NKX2-5基因多态性联合血清白细胞介素-6、正五聚蛋白3浓度对风湿性心脏病合并心房颤动患者的预测价值

目的探讨NKX2-5基因多态性联合血清白细胞介素(interleukin,IL)-6、正五聚蛋白3(pentraxin 3,PTX3)浓度对风湿性心脏病(rheumatic heart disease,RHD)合并心房颤动(atrial fibrillation,AF)患者的预测价值。方法选取成都医学院第三附属医院2017年1月至2020年12月收治的156例RHD患者作为研究对象,根据患者病程中是否出现AF,分为AF组(81例)和非AF组(75例)。对两组患者NKX2-5基因多态性及血清IL-6、PTX3浓度进行比较分析,采用Logistic回归分析对RHD患者并发AF的危险因素进行分析,并通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析各因素的预测能力。结果AF组患者NKX2-5基因rs251253位点AG型(37.0%vs.18.7%,χ^(2)=6.490,P=0.011)和AA型(11.1%vs.2.7%,χ^(2)=4.237,P=0.040)患者比例明显高于非AF组,差异有统计学意义;AF组患者A等位基因分布频率明显高于非AF组,差异有统计学意义(28.4%vs.13.3%,χ^(2)=14.513,P<0.001)。相对于非AF组患者,AF组患者血清IL-6和PTX3浓度明显升高,差异具有统计学意义[IL-6:(17.00±4.61)ng/L vs.(10.80±4.01)ng/L,t=8.931,P<0.01;PTX3:(2.50±0.67)mg/L vs.(1.23±0.46)mg/L,t=13.695,P<0.01]。二元Logistic回归分析提示,血清IL-6(OR=1.360,95%CI:1.189~1.555)和PTX3(OR=4.896,95%CI:2.237~10.716)浓度升高及NKX2-5基因rs251253位点突变(OR=12.777,95%CI:4.576~35.677)是RHD患者合并AF的独立危险因素。ROC分析结果提示IL-6、PTX3和NKX2-5基因多态性的曲线下面积分别为0.778、0.751和0.723,而三者联合预测概率的曲线下面积为0.902,相较于单个指标显著提升,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论采用CNKX2-5基因多态性联合血清IL-6、PTX3浓度可显著提升对RHD患者合并AF的预测价值,值得临床进一步推广。

外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化

目的:构建人Nkx2-5基因融合绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,探讨外源性Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化的作用。方法:以真核表达质粒pEFSA-HA-Nkx2-5为模板,PCR扩增得到人Nkx2-5基因,将目的片段亚克隆到pEGFP-N1载体,鉴定正确。将重组质粒pEGFP-N1-Nkx2-5以脂质体法转染P19细胞,G418筛选2周,聚集4d,贴壁培养16d。以免疫细胞化学检测desmin、α-sarcomeric actin和cardiac Troponin T(cTnT)的表达。结果:将Nkx2-5基因正确插入pEGFP-N1载体,外源表达Nkx2-5基因可使P19细胞在无诱导剂、聚集条件下表达desmin、α-sarcomeric actin和cTnT蛋白。结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化。

法乐四联症患儿NKX2.5、TBX5、GATA4基因的表达研究

目的:探讨NKX2.5、TBX5、GATA4基因与法乐四联症的发病关系及法乐四联症形成的分子机制。方法:10例法乐四联症患儿(法乐四联症组),为我院2005-06至2005-12心脏中心住院患儿。年龄4个月～8岁,平均3.5岁。6例非先天性心脏病(先心病)意外死亡患儿作为对照(对照组),均没有先心病病史和遗传病家族史。年龄4个月～9岁,平均年龄3.8岁。留取各病例右心室流出道心肌组织,提取心肌组织总RNA,逆转录为与RNA链互补的单链DNA(cDNA)。按照引物设计原则进行引物设计,用来扩增心肌组织NKX2.5、TBX5、GATA4、GAPDH mRNA目的片段。引物长度18bp～22bp,扩增片段长度163bp、206bp、237bp、203bp。应用双标准曲线、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法比较NKX2.5、TBX5、GATA4基因的mRNA含量在对照组和法乐四联症组之间的统计学差异。结果:法乐四联症组的NKX2.5mRNA含量较对照组显著降低,差异有统计学意义。TBX5mRNA和GATA4mRNA含量在法乐四联症组与对照组的差异无统计学意义。结论:人心肌组织中有心脏发育相关基因NKX2.5、TBX5和GATA4mRNA的表达;法乐四联症可能与心肌组织中NKX2.5mRNA含量降低相关。

Nkx2-5基因诱导P19细胞分化中心肌标志物的表达

目的研究同源框基因Nkx2-5在心肌发生中的作用。方法实验分转染组和未转染组,转染组细胞为稳定表达Nkx2-5的P19细胞,未转染组细胞为P19细胞。两组细胞悬浮培养4d,形成聚集体后贴壁培养,于贴壁培养的4、8、12、16d,免疫细胞化学检测α横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin,α-SA)和心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)的表达;RT-PCR检测GATA-4、α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)、心房利钠因子(atrial natriuretic factor,ANF)基因的表达。结果转染组α-SA和cTnT两种蛋白在聚集体贴壁的8、12、16d出现表达,表达量有增高趋势;16d与8d比有显著差异(P<0.01);RT-PCR结果显示:转染组GATA-4在贴壁培养的4d有表达,8、12d表达逐渐增多,16d时表达有所下降。α-MHC和ANF在贴壁培养的8d有表达,12d和16d时表达逐渐增多。统计结果表明GATA-4在8、12、16d的表达量与4d比有显著差异(P<0.05或P<0.01),α-MHC在12、16d的表达量与8d比有显著差异(P<0.05,P<0.01),ANF在16d的表达量与8d比有显著差异(P<0.01),16d表达量与12d比也有显著差异(P<0.01);未转染组结果均为阴性。结论外源表达Nkx2-5基因可诱导P19细胞逐渐表达心肌标志物。

转录因子Nkx2.5、ISL-1表达与小鼠胚胎心的早期发育

目的：探讨转录因子Nkx2.5和ISL-1的表达与小鼠胚胎早期心发育的关系.方法：胚龄7.5～13d小鼠胚胎连续石蜡切片,用抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗转录因子ISL-1、抗Nkx2.5抗体,进行免疫组织化学显色.结果：转录因子Nkx2.5在胚龄7.5d生心板表达早于心肌特异性蛋白MHC及SMA.随心外形建立,Nkx2.5在心各部表达逐渐增强.胚龄9d, Nkx2.5阳性表达从原始心管动脉端延伸至心包腔背侧脏壁中胚层及咽周围轴旁中胚层.Isl-1开始表达于胚龄8d原始心管心背系膜及前肠腹侧脏壁中胚层间充质,阳性细胞数量在11～12d达顶峰,形成前肠腹侧连接流出道远端和心房背侧壁的ISL-1阳性细胞带.11～12d,流出道远端出现Nkx2.5和MHC阴性,ISL-1、SMA阳性表达区.胚龄13d后,Nkx2.5和ISL-1在心和前肠腹侧间充质的表达强度下降.结论：Nkx2.5是原始生心区心肌前体细胞早期分化的标记蛋白,在第2生心区表达限于胚龄9d、咽周脏壁和轴旁中胚层心肌前体细胞亚群.第2生心区标记蛋白ISL-1主要表达在胚龄8～12d前肠腹侧脏壁中胚层心肌前体细胞,并向心管添加心肌细胞,参与流出道发育及心管成襻.11d后,第2生心区间充质细胞开始分化为升主动脉和肺动脉干平滑肌.

Nkx2-5基因的克隆及其与黑色素细胞黑色素生成相关性的研究

本实验旨在探究Nkx2—5基因在小鼠黑色素细胞中是否表达，同时通过生物信息学的方法预测其是否与调控黑色素生成的基因有相互作用。结果表明：转录因子Nkx2—5在小鼠黑色素细胞中表达，其编码的蛋白作为转录因子与下游基因作用的主要位点在144～196位氨基酸残基处，且其在黑色素生成中的关键基因MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的启动子中都有作用位点，同时Nkx2—5蛋白与对神经嵴分化有重要影响的Hand1、Hand2存在相互作用，故可以推测转录因子Nkx2—5在黑色素细胞的黑色素生成中发挥着重要的作用，进而为从分子水平解释动物被毛白化的发病机理提供新的思路。

NKX2-5基因与先天性心脏病的关系

目的:探讨NKX2-5基因与先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)的关系。方法:收集130例无血缘关系的CHD患者的临床资料和血标本,以100名无血缘关系的健康者为对照。应用聚合酶链反应扩增CHD候选基因NKX2-5的全部外显子和外显子两侧的部分内含子,采用双脱氧核苷链末端合成终止法对全部扩增片段进行测序。将所测的序列与GenBank数据库中公布的NKX2-5基因序列进行比对以识别出NKX2-5基因变异。比较识别出的NKX2-5基因多态在CHD患者和健康对照者间的频率分布差异。结果:在CHD患者的NKX2-5基因识别出2个单核苷酸多态,一个是NKX2-5基因编码序列第63位的腺嘌呤(A)变为鸟嘌呤(G),即c.63A>G多态;另一个是NKX2-5基因编码序列第606位的G变为胞嘧啶(C),即c.606G>C多态。在NKX2-5基因第606位点的等位基因G、C及其构成的3种基因型GG、GC、CC在CHD患者和健康对照者间的频率分布有显著性差异(等位基因频率比较:χ2=4.125,P=0.042;基因型频率比较:χ2=4.279,P=0.039)。但在NKX2-5基因第63位点的等位基因A、G及其构成的3种基因型AA、AG、GG在CHD患者和健康对照者间的频率分布无显著性差异(等位基因频率比较:χ2=0.704,P=0.402;基因型频率比较:χ2=0.626,P=0.429)。结论:NKX2-5基因c.606G>C多态可能与CHD有关,等位基因606C携带者可能对CHD的易感性增加。

5-氮胞苷诱导外源表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化的研究

目的研究在单层培养条件下,5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化的可能性和效率。方法实验分为实验组和对照组,实验组细胞为稳定表达Nkx2-5的P19细胞,对照组为P19细胞。2组细胞均在单层培养条件下,以5-aza(1μmol/L)诱导。倒置显微镜观察细胞的生长状态;诱导4、8、12、16d,Western blot检测α-sarcomeric actin和cTnT的表达;并用免疫荧光双标检测α-sarcomeric actin和cTnT的共表达。结果实验组和对照组细胞在5-aza诱导下,生长缓慢,死亡细胞数目增多。随贴壁细胞密度增加,形成类似于聚集体贴壁生长的状态,中心细胞小、密集,周边细胞呈放射状排列,胞体长梭形,伸出突起。实验组诱导8、12、16d检测到α-sarcomeric actin和cTnT2种蛋白的表达和共表达,表达量呈增多趋势;诱导12、16d时α-sarcomerica ctin的表达量与8d比差异有统计学意义(P<0.01),诱导16d的表达量与12d比差异有统计学意义(P<0.01);cTnT在诱导12、16d的表达量与8d比差异有统计学意义(P<0.01)。对照组没有2种蛋白的表达和共表达。结论5-aza可诱导单层生长的表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化。

转录因子NKx2-5表达在大鼠右心室心肌重塑模型的变化

目的:观察增加大鼠右心室压力负荷后,右心室心肌重塑与同源盒转录因子NKx2-5表达的变化。方法:注射野百合碱(MCT)制作大鼠肺动脉高压模型,测量大鼠不同时间点肺动脉压和右心室肥厚指数;采用RT-PCR法和Westernblot分析,分别测定右心室心肌NKx2-5及其下游基因心房利钠因子(ANF)的mRNA及蛋白表达。结果:注射MCT后第14天,右室心肌明显肥厚,NKx2-5与ANF的mRNA及蛋白表达亦明显增加,与其呈明显正相关。结论:右心室壁压力负荷增加可作为原发性刺激,使在心脏胚胎发育早期表达的心脏同源盒基因NKx2-5表达增加,NKx2-5在成熟心肌重塑中可能起作用。

纳米金-银加强法对骨髓微环境中Nkx2-5^+细胞定位的实验研究

目的应用包埋前纳米金-银加强法,电镜观察骨髓微环境中Nkx2-5+细胞并进行形态学分析。方法取BALB/c小鼠双后肢胫骨,脱钙后行冰冻切片,利用1.4 nm超微纳金颗粒标记骨髓纵切面Nkx2-5+的细胞,通过银加强使金颗粒增大,Epon 812树脂包埋,常规超薄切片,电镜下观察。结果免疫金颗粒主要标记Nkx2-5+细胞的胞质,极少数胞核也可见到免疫金颗粒。免疫金颗粒标记细胞均为体积较大的骨髓单核细胞,偶见双核细胞。结论包埋前纳米金-银加强法除可应用于神经系统的研究外,也可应用于骨髓微环境中抗原的精确定位。

妊高症患者胎盘MiR-26b和Nkx2-5的表达水平及临床意义

目的探究妊娠高血压疾病患者胎盘micro RNA-26b(MiR-26b)和Nkx2-5的表达水平及临床意义。方法选择2016年3月～2017年10月于笔者医院接受治疗的60例妊高症患者(包括20例妊娠期高血压、20例轻度子痫前期和20例重度子痫前期)为实验组,另选择同期住院的20例健康孕妇作为对照组。实时定量PCR(q RT-PCR)技术检测胎盘组织MiR-26b水平;蛋白质印迹(Western blot)技术检测胎盘组织Nkx2-5水平。结果轻度子痫前期组和重度子痫前期组的新生儿体重及胎盘重量较健康对照组均显著降低(P<0.05)。q RT-PCR结果显示,妊娠期高血压组、轻度子痫前期组和重度子痫前期组胎盘组织MiR-26b水平较健康对照组均显著升高(P<0.05),且随着病情的加重,MiR-26b水平逐渐上升(P<0.05)。Western blot法检测结果显示,妊娠期高血压组、轻度子痫前期组和重度子痫前期组胎盘组织Nkx2-5水平较健康对照组均显著降低(P<0.05),且随着病情的加重,MiR-26b水平逐渐降低(P<0.05)。妊高症患者胎盘组织MiR-26b水平与Nkx2-5水平显著呈负相关(P<0.05)。妊高症患者胎盘组织MiR-26b水平与新生儿体重、胎盘重量呈负相关(P<0.05),Nkx2-5水平与新生儿体重、胎盘重量显著呈正相关(P<0.05)。结论妊高症患者胎盘组织中MiR-26b表达上调、Nkx2-5表达下调,且与病情严重程度相关,暗示MiR-26b、Nkx2-5可作为妊高症的独立诊断因子。

同源盒基因Nkx2-5促进5-氮胞苷诱导的单层P19细胞表达心肌标志物

目的:探讨同源盒基因Nkx2-5基因在5-氮胞苷(5-aza)诱导单层生长的P19细胞向心肌细胞分化中的作用。方法:以稳定表达Nkx2-5的P19细胞为实验组,P19细胞为对照组。两组细胞均单层培养并以5-aza(1μmol/L)诱导,倒置显微镜下观察细胞的生长状态;在诱导后4、8、12、16 d,以RT-PCR检测转录因子GATA-4、α-肌球蛋白重链(α-MHC)和心房利钠多肽(ANP)基因的表达。结果:对照组经5-aza诱导后ANP没有表达;GATA-4在8、12、16 d有表达;α-MHC在12、16 d有表达。实验组5-aza诱导后,GATA-4在诱导4、8、12、16 d有表达;α-MHC和ANP都是在5-aza诱导后的8、12和16 d表达。两组结果比较显示实验组GATA-4和α-MHC基因的表达时间提前;两组除α-MHC在12 d的表达无差异外,其他取材时间点实验组两个基因的表达量与对照组相比均增高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论:Nkx2-5促进5-aza诱导的单层生长的P19细胞向心肌分化。

NKX2-5诱导P19细胞向心肌分化的研究

目的探索NKX2-5在心肌分化中的作用和机制。方法实验分转染组和未转染组,转染组为稳定表达NKX2-5的P19细胞,未转染组为P19细胞。两组细胞悬浮培养4d,形成聚集体后贴壁培养,于贴壁培养的4d、8d、12d、16d,免疫荧光双标和Western blot检测横纹肌α肌动蛋白(α-SA)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达;取贴壁培养16d的细胞透射电镜观察细胞超微结构变化。结果转染组α-SA和cTnT两种蛋白在聚集体贴壁4d时没有表达,8d、12d、16d出现表达和共表达。转染组部分细胞出现幼稚的细胞连接和肌丝样结构;未转染组没有发现两种蛋白的表达,电镜观察未发现分化的细胞。结论稳定表达NKX2-5基因的P19细胞可向心肌分化,但不适于作为心脏发育的体外模型。

表达大鼠融合蛋白NKX2.5-pEGFP的骨髓间充质干细胞的建立

目的:构建大鼠NKX2.5融合绿色荧光蛋白真核表达质粒NKX2.5-pEGFP,并筛选表达大鼠融合蛋白NKX2.5-pEGFP的骨髓间充质干细胞(MSCs),为后续性细胞和基因治疗心肌梗死提供理论基础。方法:提取胎鼠心肌细胞总RNA,RT-PCR扩增获得大鼠NKX2.5基因,将目的基因克隆到pEGFP-N3载体并获得重组后NKX2.5-pEGFP质粒。采用密度梯度离心法联合贴壁法分离骨髓单个核细胞并获得MSCs。将重组质粒NKX2.5-pEGFP以Lipo2000转染到大鼠MSCs,G418筛选2周。蛋白免疫印记和荧光检测重组后质粒在骨髓间充质干细胞中的表达情况。结果:电泳检测证实经RT-PCR获得NKX2.5基因大小为981bp,与理论值相符。NKX2.5-pEGFP重组质粒经BamHⅠ、SalⅠ双酶切,PCR鉴定得到2条大小约为981和4 700bp的酶切片段,鉴定结果与预期结果完全一致。蛋白免疫印记检测到转染重组质粒的MSCs中有相对分子质量为65 000的蛋白表达,与理论值相符。荧光检测NKX2.5-pEGFP重组质粒转染的MSCs中可见绿色荧光,证实表达阳性。结论:成功建立表达大鼠NKX2.5-pEGFP基因的MSCs。

先天性心脏病圆锥动脉干畸形NKX2-5基因CpG岛甲基化状态分析

目的研究心肌特异性转录因子NKX2-5基因启动子区在先天性心脏病圆锥动脉干畸形(CTD)病例中的甲基化状态,从表观遗传学角度探讨先心病的发病机制,为先心病的早期临床诊治提供理论依据。方法首先利用Tru1l限制性内切酶将基因组片段化并接上接头,然后利用甲基化结合蛋白(MBD)与甲基化DNA特异性结合的特点对甲基化DNA片段进行富集;针对NKX2-5基因启动子区的CpG岛设计引物,通过实时定量PCR检测CTD与正常胎心组织中NKX2-5基因甲基化状态。结果通过与正常心脏组织相比,NKX2-5基因在6例病变组织中均发生了不同程度的甲基化,其中4例呈现高甲基化,另外2例甲基化程度无明显变化。结论 NKX2-5基因甲基化可能与先心病CTD发病相关,可能成为先心病早期诊断的分子标志物之一。

3个鸡种NKX2-5基因多态性与胫长的关联性分析

以贵州特有鸡种高脚鸡、矮脚鸡和百宜黑鸡为试验对象,利用PCR-SSCP和DNA测序等方法检测了NKX2-5基因T563C、C675T位点在3个试验鸡群中不同基因型与胫长的关联性。T563C与胫长关联分析表明,高脚鸡群体中TT基因型个体胫长显著高于CC型,百宜黑鸡群体中TT基因型显著高于CT型,矮脚鸡群体中不同基因型个体间胫长差异不显著;C675T突变位点在3个鸡种中只有CC和CT两种基因型,且各鸡种不同基因型个体间胫长差异不显著。

对海南省210例散发性先天性单纯性心脏病患者NKX2-5、GATA4、ZIC3基因突变的筛选研究

目的:心脏发育异常可导致先天性心脏病(congenital heart disease,CHD),是国内外最常见的先天性畸形,已知NKX2-5、GATA4和ZIC3基因突变可引起CHD。本实验探讨了海南省NKX2-5、GATA4、ZIC3基因突变和散发性先天性单纯性心脏病之间的关系。方法:收集210例散发性CHD患者,提取患者血液DNA,扩增目的基因片段,利用高分辨熔解曲线(high-resolution melting,HRM)技术和DNA测序技术,分析NKX2-5、GATA4和ZIC3基因的序列。结果:对210例CHD患者NKX2-5、GATA4、ZIC3基因测序,发现7个基因突变,包括1个NKX2-5杂合错义突变(c.178G>T),GATA4的3个杂合突变(c.677C>T,c.928A>G,c.1123G>A),ZIC3的3个杂合突变(c.19G>C,c.1255C>G,c.1348C>T)。其中NKX2-5(c.178G>T)、GATA4(c.1123G>A)、ZIC3(c.19G>C,c.1255C>G,c.1348C>T)为新突变位点。通过生物信息学软件预测这些基因突变为致病性突变。结论:在210例患者中发现了7个基因突变,首次报道海南省NKX2-5、GATA4和ZIC3的基因突变与CHD发病相关。

大鼠BMSCs向心肌样细胞分化过程中miR-128对Nkx2-5基因的调控作用

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化过程中miR-128对Nkx2-5基因的调控作用。方法分离培养大鼠BMSCs,应用5-氮杂胞苷将其诱导为心肌样细胞,采用Real-time PCR法检测诱导6、10、14、18、22 d时miR-128、Nkx2-5基因的表达。用生物信息学方法对miR-128和Nkx2-5基因的靶向匹配关系进行预测,显示miR-128与Nkx2-5 mRNA的3'UTR结合情况良好。提取心肌细胞总RNA,扩增Nkx2-5 mRNA 3'UTR片段,构建Nkx2-5 3'UTR-pmir GLO荧光素酶报告载体,双荧光素酶检测转染Nkx2-5 3'UTR-pmir GLO以及miR-128模拟物或对照miRNA的荧光强度,鉴定miR-128与Nkx2-5的靶向关系。结果将诱导6 d的Nkx2-5和miR-128的表达量分别设为1,诱导10 d的Nkx2-5表达量为4.33±1.32、22 d为14.78±6.05,诱导10 d的miR-128表达量为0.776 2±0.054 3、22 d为0.197 6±0.083 6。miR-128与Nkx2-5的表达呈负相关(r=-0.546,P=0.021)。相对于转染对照miRNA(设定其荧光素酶活性为1),转染miR-128能使Nkx2-5 3'UTR-pmir GLO的荧光素酶表达下降为0.435 4±0.072 6。结论 miR-128通过结合Nkx2-5 mRNA 3'UTR抑制其表达,具有负性调控BMSCs向心肌样细胞分化过程中Nkx2-5表达的作用。

心肌急性梗死对骨髓及外周血心肌转录因子Nkx2-5的影响

目的观察小鼠心肌梗死后,骨髓及外周血单核细胞心肌特异性转录因子Nkx2-5的变化。方法用大剂量异丙肾上腺素(10 mg/kg)连续注射3天造成小鼠心肌急性缺血性梗死模型,第3天注射后30 min,通过眼球摘除法取外周血,分离双后肢股骨、胫骨,冲洗骨髓腔得骨髓液,经密度梯度离心分离出骨髓及外周血单核细胞,正常组同心肌缺血梗死组。通过细胞Western blotting分析,比较正常组和心肌梗死组骨髓及外周血单核细胞中心肌特异性转录因子Nkx2-5的变化。结果正常骨髓单核细胞中存在Nkx2-5的表达,正常外周血单核细胞中Nkx2-5无表达;心肌梗死后骨髓及外周血Nkx2-5表达均明显增加,同正常组比较有统计学意义,P<0.05。结论正常骨髓中无需培养或诱导即存在表达Nkx2-5的单核细胞,在心肌急性梗死后向外周血动员增加。

NKX2-5在乳腺癌患者他莫昔芬耐药中的作用及调控机制

目的探讨NKX2-5在乳腺癌患者他莫昔芬(TAM)耐药中的作用及调控机制。方法采用免疫组化染色检测乳腺癌组织和癌旁组织NKX2-5的表达。利用高通量基因表达数据库(GEO)分析乳腺癌患者的相关资料及NKX2-5表达与乳腺癌患者生存率的关系。构建乳腺癌TAM耐药细胞株(MCF-7/TAM),采用CCK-8试剂盒检测不同浓度TAM处理后细胞增殖的变化,免疫印迹法检测细胞相关蛋白表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞NKX2-5 mRNA的表达。结果癌旁组织NKX2-5表达明显高于癌组织(P<0.05)。TAM敏感组织NKX2-5表达明显高于TAM耐药组织(P<0.05)。NKX2-5低表达组总生存率和无病生存率明显低于NKX2-5高表达组(P<0.05);在接受TAM治疗的乳腺癌患者中,NKX2-5低表达组总生存率明显低于NKX2-5高表达组(P<0.05)。与MCF-7细胞比较,MCF-7/TAM细胞NKX2-5蛋白表达明显降低(P<0.05)。采用瞬时转染技术将NKX2-5过表达质粒(Ad-NKX2-5)、空载质粒(Ad-NC)转染MCF-7/TAM细胞(Ad-NKX2-5组、Ad-NC组),NKX2-5小干扰RNA质粒(NKX2-5-siRNA)、空白对照(NC-siRNA)转染MCF-7细胞(NKX2-5-siRNA组、NC-siRNA组)。采用50、100μmol/L TAM处理后,Ad-NKX2-5组细胞增殖抑制率明显高于Ad-NC组(P<0.05),NKX2-5-siRNA组细胞增殖抑制率明显低于NC-siRNA组(P<0.05)。MCF-7/TAM细胞磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-P38MAPK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)蛋白表达明显高于MCF-7细胞(P<0.05)。Ad-NKX2-5组p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表达明显低于Ad-NC组(P<0.05),NKX2-5-siRNA组p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表达明显高于NC-siRNA组(P<0.05)。结论乳腺癌TAM耐药细胞中NKX2-5表达下调。上调NKX2-5表达或许能通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路逆转MCF-7细胞TAM耐药。