Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白12在自身炎症性疾病中的研究进展

Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白12(NLRP12)作为发现较晚的Nod样受体家族成员,是重要的模式识别受体之一,识别多种病原体并启动下游免疫应答,参与多项机体炎症反应的调控,与自身炎症性疾病的发生、进展相关。现从其结构、功能及NLRP12相关自身炎症性疾病等方面对NLRP12进行综述,探讨NLRP12在自身炎症中的作用机制,为认识、探索、治疗NLRP12相关自身炎症疾病提供新思路。

血红素激活含pyrin结构域NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)炎性体诱导肾小管上皮细胞焦亡

目的研究血红素是否通过活化肾小管上皮细胞含pyrin结构域NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)炎性体引起焦亡而损伤肾脏功能。方法使用血红素处理人肾小管上皮HK-2细胞,通过扫描电镜观察细胞膜上是否有穿孔,免疫荧光染色检测焦亡执行蛋白消皮素D氨基端蛋白(GSDMD-N)的形成情况,明确血红素是否引起人肾小管上皮HK-2细胞焦亡。通过Western blot法检测NLRP3炎性体相关蛋白分子NLRP3、含胱天蛋白酶募集结构域凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶l前体(pro-caspase-1)和剪切体(caspase-1 p20)、白细胞介素1β前体(pro-IL-1β)和IL-1β等确定血红素是否引起人肾小管上皮HK-2细胞中NLRP3炎性体的活化;通过异体输血构建小鼠溶血模型在动物水平进一步验证溶血释放的血红素是否活化NLRP3炎性体而导致肾损伤。采集静脉血进行血涂片进行Wright-Giemsa染色光镜观察,分光光度计比色法检测游离血红蛋白;全自动生化分析仪检测血清尿素氮以及HE染色观察肾组织病变情况确定溶血模型建立是否成功;分离提取溶血小鼠肾小管上皮细胞,Western blot法检测NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、pro-IL-1β、IL-1β、GSDMD-N蛋白表达情况明确溶血模型中NLRP3炎性体的活化情况以及焦亡执行蛋白的表达。结果血红素造成肾小管上皮HK-2细胞损伤,细胞膜上出现小孔,焦亡执行蛋白GSDMD-N表达增高,HK-2细胞中NLRP3炎性体相关蛋白caspase-1 p20、IL-1β表达上调;溶血模型小鼠的肾脏功能受损,小鼠肾小管上皮细胞中NLRP3炎性体相关蛋白caspase-1 p20、IL-1β、GSDMD-N表达上调。结论血红素活化肾小管上皮细胞的NLRP3炎性体,诱导焦亡,进而导致肾功能损伤。

含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)炎性体抑制剂及其作用机制研究进展

含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)炎性体是由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)及胱天蛋白酶1(caspase-1)组成的蛋白复合体,主要介导白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18的前体成熟参与炎症反应。NLRP3炎性体的异常活化与代谢紊乱、神经退行性疾病、自身免疫性疾病等炎症性疾病的发生发展关系密切。寻找并开发NLRP3炎性体的有效抑制剂成为治疗炎症性疾病的新策略。我们总结了已报道的在NLRP3炎性体活化的起始阶段和激活阶段发挥作用的抑制剂及其作用机制,期望为开发以NLRP3炎性体为靶点的抗炎药物提供新思路。

NOD样受体家族含CARD结构域5在胃癌中的相互作用蛋白及其对胃癌的诊断价值

目的 探究NOD样受体家族含CARD结构域5(NLRC5)在胃癌中的相互作用蛋白,并明确其对胃癌的诊断价值。方法 采用癌症基因组图谱(TCGA)数据库探究NLRC5在胃癌组织和癌旁组织中的差异,结合STRING网站分析NLRC5的相互作用蛋白,通过基因表达综合(GEO)数据库验证TCGA数据库筛选出来的蛋白对胃癌的诊断价值。引用临床模型,验证筛选出来的蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的表达情况,确定各蛋白间的相关性,通过受试者工作特征(ROC)曲线明确其对胃癌的诊断价值。结果 TCGA结果显示,胃癌组织中NLRC5表达水平明显高于癌旁组织(P﹤0.01)。蛋白-蛋白相互作用发现,核因子κB激酶复合物抑制剂组分(CHUK)、核因子κB激酶亚单位β的抑制剂(IKBKB)、三重基序蛋白25(TRIM25)与NLRC5均呈正相关。经过GEO数据库验证得到TRIM25、CHUK、IKBKB与NLRC5可以构建联合模型诊断胃癌。临床模型中NLRC5在胃癌组织中高表达,且与TRIM25、IKBKB、CHUK表达水平均呈正相关(P﹤0.01)。NLRC5联合TRIM25、IKBKB、CHUK对胃癌有较高的诊断价值。结论 TRIM25、IKBKB、CHUK参与NLRC5在胃癌发展中的相关调控机制,在胃癌诊断中具有较高的效能。

核苷酸结合寡聚结构域样受体(NLR)在免疫代谢中的研究进展

固有免疫中的核苷酸结合寡聚结构域样受体(NLR)家族对免疫功能的发挥起着至关重要的作用。含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)、核苷酸结合寡聚结构域样受体X1(NLRX1)和含CRAD结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRC3)是NLR家族中的关键成员,它们与免疫代谢之间的关联成为研究的新焦点。NLRP3的激活可促进炎性小体的组装,导致白细胞介素1β(IL-1β)的激活,进而引发炎症反应。NLRC3则能抑制核因子κB(NF-κB)和干扰素基因刺激物/TANK结合激酶1(STING/TBK1)信号通路的激活,以及炎性小体的形成,进而调控免疫反应。而NLRX1则通过调节Ⅰ型干扰素、NF-κB信号传导以及自噬等过程,对免疫应答进行精细调控。这些NLR成员不仅参与病原体的识别,更与免疫代谢的调控密切相关。对NLR家族的深入研究将有助于揭示免疫代谢的奥秘,为疾病的治疗提供新的思路。

炎性体成分NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3对重型颅脑损伤患者预后评估的价值

目的探讨炎性体成分NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）对重型颅脑损伤患者预后评估的价值。方法采用酶联免疫吸附法检测20例重型颅脑损伤患者脑脊液NLRP3浓度，结合格拉斯哥预后评分（GOS）等临床资料对比分析。结果重型颅脑损伤患者脑脊液NLRP3浓度为（33．8±11．6）μg/L，明显高于中型颅脑损伤组[（11．4±2．9）μg/L，P〈0．01]和正常对照组[（1．1±0．3）μg/L，P〈0．01]；预后不良组NLRP3浓度为（42．8±14．4）μg/L，明显高于预后良好组[（29．9±7．9）μg／L，P〈0．05]；患者NLRP3浓度与CT表现（r=0．601，P〈0．01）及GOS评分（r=0．665，P〈0．01）明显相关。结论脑脊液中NLRP3水平可以反映脑损伤程度，可作为评估颅脑损伤患者预后的标志物。

二甲双胍通过腺苷酸活化蛋白激酶-Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

目的观察二甲双胍通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)-Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3(NLRP3)对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。方法成年SD大鼠随机数字表法分为对照组、模型组和二甲双胍组,采用结扎左冠状动脉前降支构建大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。二甲双胍组大鼠建模前灌胃给于二甲双胍250 mg/kg,对照组和模型组给与等体积生理盐水。3组大鼠再灌注2 h后,采用生化酶法检测心肌损伤标志物酸激酶(CK-MB)和肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ);采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色和原位缺口末端标记法(TUNEL)染色分析大鼠心肌组织梗死面积和凋亡指数;采用酶联免疫吸附测定(ELISA)分析白细胞介素(IL)-1β和IL-18的表达水平;采用蛋白质印迹法(Western blot)分析大鼠心肌组织AMPK、NLRP3和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-1表达水平。计量组数比较采用单因素方差分析。结果二甲双胍组大鼠心肌梗死比例[(26.14±4.71)%]明显低于模型组大鼠心肌梗死比例[(43.74±15.00)%],差异有统计学意义(t=3.540,P<0.05)。二甲双胍组大鼠血清CK-MB和cTnⅠ水平[(1821.88±213.52)U/L、(1.45±0.13)ng/L]明显低于对照组[(3100.87±149.41)U/L、(3.08±0.25)ng/L],差异有统计学意义(t=15.520、18.240,P<0.05)。二甲双胍组大鼠心肌凋亡比例[(10.56±2.36)%]明显低于模型组大鼠心肌凋亡比例[(27.43±3.90)%],差异有统计学意义(t=11.710,P<0.05)。二甲双胍组大鼠心肌组织磷酸化AMPK表达水平(1.22±0.11)明显高于对照组和模型组大鼠心肌组织(0.59±0.08、0.81±0.06),差异有统计学意义(t=14.370、10.510,P<0.05)。二甲双胍组大鼠心肌组织NLRP3和Caspase-1蛋白表达水平(1.19±0.15、1.24±0.10)明显低于模型组大鼠心肌组织(1.78±0.12、1.82±0.16),差异有统计学意义(t=9.895、9.554,P<0.05)。二甲双胍组大鼠血清IL-1β和IL-18水平[(98.20±7.25)、(94.90±8.57)pg/ml]明显低于模型组大鼠血清IL-1β和IL-18水平[(148.70±15.33)、(156.10±21.03)pg/ml],差异有统计学意义(t=9.414、8.633,P<0.05)。结论二甲双胍通过激活AMPK,抑制NLRP3介导的炎性反应,对缺血再灌注损伤心肌起保护作用。

Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白-3 mRNA在儿童类风湿关节炎中的表达对比研究及临床意义

目的检测儿童类风湿关节炎亚型（S-JIA、JIA少关节型）外周血Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白-3（NLRP-3） mRNA基因表达差异，探讨NLRP-3 mRNA表达水平差异与患儿临床表现特征的相关性。 方法收集28例初治类风湿关节炎（S-JIA13例，JIA少关节型15例）住院患儿及20例同期正常体检患儿的外周血标本，提取标本总RNA，实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测外周血标本中NLRP-3 mRNA表达的差异。 结果在外周血中NLRP-3 mRNA在S-JIA组的相对表达量为0.066 7±0.004 4，高于JIA少关节型组（0.010 7±0.001 5）及正常对照组（0.021 3±0.003 2），差异有统计学意义（F＝5.491，P＝0.010）；正常对照组与JIA少关节型组之间比较时，差异无统计学意义（F＝1.745，P＝0.105）。 结论NLRP-3 mRNA水平升高，是导致S-JIA产生炎性反应的重要影响因素之一。

青蒿素抑制Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3复合物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨青蒿素抑制Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3(NLRP3)复合物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法选用SD大鼠,结扎左冠状动脉前降支,构建大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,并随机分为对照组、模型组和青蒿素组,每组10只。其中10只不结扎的大鼠作为假手术组。青蒿素组大鼠建模前灌胃25 mg/kg青蒿素,模型组和对照组建模前灌胃等体积生理盐水。3组大鼠造模1 d后采用生化酶法检测心肌损伤标志物酸激酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ);采用TTC染色分析3组大鼠梗死百分比;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析白细胞介素(IL)-1β和IL-18的表达水平;采用蛋白质印迹法(Western blot)分析大鼠心肌组织半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-1/NLRP3表达水平。组间比较采用单因素方差分析。结果青蒿素组大鼠血清CK-MB、LDH和cTnⅠ水平[(2424.30±199.06)U/L、(1128.30±118.46)U/L、(35.26±3.56)pg/ml]明显低于模型组[(4105.10±191.55)U/L、(1682.00±155.21)U/L、(73.46±8.67)pg/ml],差异有统计学意义(t=19.240、8.968、12.890,P<0.05)。青蒿素组大鼠心肌梗死百分比[(28.05±4.51)%]明显低于模型组[(46.07±4.27)%],差异有统计学意义(t=9.163,P<0.05)。青蒿素组大鼠血清IL-1β和IL-18水平[(92.80±7.94)、(81.40±4.50)pg/ml]明显低于模型组[(172.60±11.62)、(117.70±7.89)pg/ml],差异有统计学意义(t=17.930、12.640,P<0.05)。青蒿素组大鼠心肌组织Caspase-1和NLRP3表达水平(1.37±0.10、1.34±0.05)明显低于模型组(1.80±0.11、2.00±0.13),差异有统计学意义(t=9.542、14.670,P<0.05)。结论青蒿素通过抑制NLRP3复合物活性,降低IL-1β和IL-18表达水平,进而对大鼠缺血再灌注损伤心肌组织起保护作用。

猪颈动脉粥样硬化斑块易损性与Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3炎性小体的关系

目的 观察小型猪颈动脉粥样硬化模型中斑块组织Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎性小体的表达.方法 高脂高胆固醇饮食联合部分结扎颈动脉方法,在6头小猪建立双侧颈动脉粥样硬化模型.3个月后观察颈动脉粥样硬化斑块中NLRP3蛋白的表达.结果 12根小猪颈动脉片段中可形成不同程度的粥样硬化改变.早期斑块中,NLRP3主要表达在新生内膜的内皮细胞;进展期斑块中,NLRP3主要分布在斑块的内皮细胞、斑块基底部和脂质核心周围.NLRP3的阳性表达评分与斑块破裂[（6.65±4.32）分比（1.77±3.15）分,P＜O.01]、斑块内出血[（6.18±4.31）分比（1.83±3.30）分,P＜0.05]和血管新生[（6.10±4.56）分比（3.69±3.57）分,P ＜0.05]密切相关.结论 小型猪动脉粥样硬化斑块中NLRP3蛋白的高表达反映了斑块易损性特征.

浸润性乳腺癌组织肝配蛋白A型受体2(EphA2)高表达且与细胞焦亡负相关

目的探讨肝配蛋白A型受体2(EphA2)参与浸润性乳腺癌中细胞焦亡(pyroptosis)的机制。方法采用Western blot法检验乳腺癌患者癌组织、癌旁组织和正常乳腺组织EphA2、含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶1(caspase-1)、白细胞介素1β(IL-1β)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)的蛋白表达水平;采用免疫荧光技术检测45例乳腺癌患者癌组织和癌旁组织中EphA2表达情况;用Pearson相关系数对患者癌组织EphA2的蛋白表达与细胞焦亡相关蛋白NLRP3、caspase-1和IL-1β进行相关性分析。结果与正常乳腺组织及癌旁组织相比,乳腺癌组中NLRP3、caspase-1、IL-1β和ICAM-1的蛋白表达水平明显降低,EphA2蛋白表达明显升高;EphA2水平与细胞焦亡相关蛋白NLRP3、caspase-1和IL-1β均呈负相关性。结论乳腺癌组织EphA2高表达,且与细胞焦亡呈负相关。

C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6(CTRP6)介导庆大霉素所致大鼠急性肾损伤

目的探讨抗炎细胞因子C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6(CTRP6)在庆大霉素所致急性肾损伤(AKI)中的作用。方法SD大鼠分为5组,对照组、模型组和3个实验组。模型组和实验组皮下注射庆大霉素400 mg/(kg·d),连续注射2 d,建立庆大霉素中毒性AKI动物模型;3个实验组大鼠在注射庆大霉素前2 d,分别给予(0.5、5、50)mg/kg的CTRP6腺病毒表达载体。苦味酸比色法检测肌酐(Cr)含量,紫外分光光度法检测血清尿素氮(BUN)含量,ELISA检测血清CTRP6的水平以及肾组织匀浆中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平。Western blot法检测肾脏组织中CTRP6、NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3(NLRP3)和caspase-1的表达。结果与对照组相比,模型组大鼠AKI指标血清BUN和Cr水平较对照组显著增高,炎症因子IL-1β和TNF-α的分泌量以及NLRP3和caspase-1蛋白表达水平也显著增加。与模型组相比,实验组大鼠血清BUN和Cr水平降低,IL-1β和TNF-α的分泌减少,NLRP3和caspase-1的表达水平下降。随着注射CTRP6腺病毒表达载体注射剂量的增加,抑制效果逐渐增强。结论 CTRP6以剂量依赖的方式减弱庆大霉素所致的大鼠急性肾功能损伤。

敲低NLRP12对高眼压大鼠RGCs的保护作用及其抑制细胞焦亡的机制

目的探讨敲低NOD样受体家族热蛋白结构域12(NLRP12)对高眼压大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)炎症因子水平和视网膜损伤的影响及其机制。方法选取70只SPF级成年雄性SD大鼠,采用随机数字表法分为对照组、高眼压组、高眼压+小干扰RNA阴性对照(siNC)组、高眼压+siNLRP12组和高眼压+siNLRP12+重组大鼠caspase-1(rrcaspase-1)组,每组14只。其中对照组仅接受右眼结膜切口处理,其他各组均采用巩膜外静脉烧灼法建立大鼠右眼高眼压模型;高眼压+siNC组、高眼压+siNLRP12组和高眼压+siNLRP12+rrcaspase-1组建立高眼压模型后分别给予尾静脉注射siNC、siNLRP12和siNLRP12+rrcaspase-1试剂。巩膜外静脉烧灼术后1 d、1周、2周、3周,测量大鼠右眼眼压;巩膜外静脉烧灼术后3周,采用苏木精-伊红染色法观察各组大鼠视网膜结构,计数各组RGCs数量。将RGCs分为对照组、rrcaspase-1组、siNC+rrcaspase-1组、siNLRP12+rrcaspase-1组,其中rrcaspase-1组、siNC+rrcaspase-1组、siNLRP12+rrcaspase-1组分别采用rrcaspase-1、siNC+rrcaspase-1和siNLRP12+rrcaspase-1处理细胞24 h,对照组不予处理。采用Western blot法检测RGCs和大鼠视网膜组织中NLRP12、caspase-1、cleaved-caspase-1蛋白表达水平;采用酶联免疫吸附测定法检测大鼠血清或细胞培养物上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素1β(IL-1β)浓度。结果与对照组比较,术后1、2、3周高眼压组眼压高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。对照组视网膜各层组织清晰,RGCs呈单层排列,高眼压组和高眼压+siNC组RGCs层松散,视网膜内丛状层变薄。高眼压+siNLRP12组视网膜内丛状层较高眼压组增厚,高眼压+siNLRP12组和高眼压+siNLRP12+rrcaspase-1组RGCs层松散。对照组、高眼压组、高眼压+siNC组、高眼压+siNLRP12组和高眼压+siNLRP12+rrcaspase-1组RGCs数量分别为(119.31±23.25)、(89.19±16.98)、(88.87±13.92)、(109.33±10.25)和(92.89±12.58)个,总体比较差异有统计学意义(F=201.932,P<0.001),其中高眼压组、高眼压+siNC组、高眼压+siNLRP12组和高眼压+siNLRP12+rrcaspase-1组RGCs数量少于对照组,高眼压+siNLRP12组RGCs数量多于高眼压+siNC组,高眼压+siNLRP12+rrcaspase-1组RGCs数量少于高眼压+siNLRP12组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高眼压组、高眼压+siNC组、高眼压+siNLRP12组和高眼压+siNLRP12+rrcaspase-1组大鼠视网膜组织中caspase-1和cleaved-caspase-1蛋白相对表达量及TNF-α和IL-1β浓度较对照组升高,高眼压+siNLRP12组较高眼压+siNC组降低,高眼压+siNLRP12+rrcaspase-1组较高眼压+siNLRP12组升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。rrcaspase-1组、siNC+rrcaspase-1组RGCs中caspase-1和cleaved-caspase-1蛋白相对表达量较对照组增加,siNLRP12+rrcaspase-1组NLRP12、caspase-1和cleaved-caspase-1蛋白相对表达量较对照组降低,rrcaspase-1组、siNC+rrcaspase-1组、siNLRP12+rrcaspase-1组TNF-α和IL-1β相对质量浓度较对照组升高,siNLRP12+rrcaspase-1组NLRP12、caspase-1和cleaved-caspase-1蛋白相对表达量及TNF-α和IL-1β相对质量浓度较siNC+rrcaspase-1组降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论敲低NLRP12可通过抑制caspase-1激活改善高眼压引发的炎症反应和视网膜损伤。

α硫辛酰胺抑制糖尿病大鼠肾组织炎症和4型胶原蛋白的产生及其机制

目的通过观察糖尿病(DM)大鼠肾组织中Notch2、含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)的表达情况及α硫辛酰胺(ALM)对Notch2、Toll样受体4(TLR4)、NLRP3和胶原蛋白表达的影响,初步探讨ALM抗糖尿病肾组织炎症和肾纤维化的可能保护机制。方法以链脲佐菌素(STZ)复制DM大鼠模型,分为DM组和ALM组,同时设正常对照组(NC组),每组8只。DM造模成功2周后,ALM组用ALM[150 mg/(kg·d)]进行灌胃,治疗6周后处死大鼠。HE和Masson染色观察肾组织形态变化,免疫组织化学染色观察肾组织中Notch2、TLR4、NLRP3的表达和定位,Western blot法检测肾组织中Notch2、TLR4、NLRP3和4型胶原蛋白(Col4)的蛋白水平,ELISA检测肾组织匀浆中炎性因子白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平。采用Spearman秩相关检验对Notch2与TLR4、NLRP3蛋白表达进行相关性分析。结果 DM组的血糖、24 h尿蛋白量、肾脏指数、总胆固醇、甘油三酯均显著高于NC组;与DM组相比,ALM组肾脏指数、24 h尿蛋白量明显降低,而血糖无明显改变。与NC组相比,DM组大鼠肾组织中Notch2、TLR4、NLRP3和Col4的蛋白水平增加,ALM组大鼠肾组织中的上述蛋白水平明显低于DM组; ALM组大鼠肾组织匀浆IL-6和TNF-α的水平较DM组明显降低。相关性分析显示在DM组以及ALM组中Notch2与TLR4的表达均呈显著正相关,Notch2与NLRP3的表达也均呈显著正相关。结论 ALM抑制DM大鼠肾组织的炎症和Col4的产生,与Notch2抑制TLR4和NLRP3的活化有关。

曲美他嗪激活自噬增加巨噬细胞胞外诱捕网抑制炎性体减少泡沫细胞胆固醇含量

目的探讨曲美他嗪(TMZ)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导泡沫细胞形成的影响及可能的作用机制。方法应用ox-LDL刺激RAW264. 7细胞建立泡沫细胞模型,分为对照组(培养基)、模型组(60μg/m L ox-LDL刺激)、氯喹(CQ)组(60μg/m L ox-LDL联合10 mmol/L CQ处理)、TMZ联合CQ组(60μg/m L ox-LDL联合80μmol/L TMZ和10 mmol/L CQ处理)。油红O染色评估泡沫细胞形成情况,ELISA试剂盒检测细胞内总胆固醇(TC)及游离胆固醇(FC)含量;单丹磺酰尸胺(MDC)染色观察自噬; Picogreen荧光染色及荧光定量PCR检测巨噬细胞胞外诱捕网(MET)形成及其含量;实时定量PCR检测自噬相关指标微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)、泛素结合蛋白P62、含pyrin结构域NOD样受体家族3 (NLRP3)、含胱天蛋白酶结构域凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶1(caspase-1)及胆固醇流出相关基因ATP结合盒亚家族A成员1(ABCA1)、ATP结合盒亚家族G成员1(ABCG1)的mRNA水平。结果与模型组相比,TMZ联合CQ组LC3B表达增加、P62表达减少,同时TC、FC、胆固醇酯(CE)/TC含量降低,此外NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表达水平均显著下调,MET形成增加。CQ组结果相反。结论曲美他嗪可以通过激活自噬、增强巨噬细胞胞外诱捕网(MET)形成并抑制炎性体形成,从而促进泡沫细胞的胆固醇流出。

胰岛素处理促进糖尿病大鼠肾皮质骨形成蛋白和激活蛋白膜结合抑制物(BAMBI)表达并抑制炎症反应

目的研究胰岛素控制糖尿病(DM)大鼠血糖后,DM大鼠肾皮质骨形成蛋白和激活蛋白膜结合抑制物(BAMBI)、含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)、凋亡相关的斑点样蛋白2(ASC-2)、胱天蛋白酶1(caspase-1)及炎性介质和相关纤维化指标的表达情况。方法SD大鼠随机分为正常对照组、DM组及胰岛素处理组。链脲佐菌素(STZ)复制DM大鼠模型,每组8只,DM成模4周后,胰岛素处理组予以皮下注射胰岛素[8 U/(kg·次)],每天3次,连续注射6周后处死大鼠。免疫组织化学染色检测肾皮质BAMBI、NLRP3、上皮钙黏素(E-cadherin)的表达,Western blot法检测肾皮质BAMBI、NLRP3、ASC-2、caspase-1、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白(FN)、Ⅳ型胶原蛋白(Col4)蛋白的表达,实时定量PCR检测肾皮质中BAMBI、NLRP3的mRNA水平,ELISA检测肾皮质中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-18的水平。采用Spearman秩相关检验对BAMBI和NLRP3蛋白表达进行相关性分析。结果与正常对照组相比,DM组肾皮质NLRP3的mRNA和蛋白水平及ASC-2、caspase-1的蛋白水平升高,α-SMA、FN、Col4蛋白表达也升高,而BAMBI的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白表达降低,胰岛素处理组NLRP3的蛋白和mRNA水平及ASC-2、caspase-1的蛋白水平低于DM组,α-SMA、FN、Col4蛋白表达也低于DM组,而BAMBI的mRNA和蛋白水平及E-cadherin的蛋白表达高于DM组;胰岛素处理组IL-1β、IL-18的水平较DM组降低,相关性分析显示在DM组以及胰岛素处理组中BAMBI和NLRP3的表达呈负相关。结论胰岛素处理可恢复DM大鼠肾皮质中BAMBI的表达,进而抑制NLRP3炎性体激活,减轻DM大鼠肾脏的炎症反应,阻止或延缓糖尿病肾病的病程进展。

需肌醇酶1(IRE1)激活NLRP3炎性体在动脉粥样硬化中的作用

动脉粥样硬化(AS)是缺血性心脑血管疾病的主要病理基础,炎症反应在疾病进程中发挥重要影响。内质网应激(ERS)下游传感蛋白需肌醇酶1(IRE1)可以通过多条途径激活含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)炎性体,二者与AS发生发展关系密切。涉及相关信号通路的关键蛋白p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、核因子κB(NF-κB)、X盒结合蛋白1(XBP1)、NADPH氧化酶(NOX)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)等与AS之间均有关联,提示ERS刺激下IRE1参与活化NLRP3炎性体是AS的可能发病机制。我们总结了IRE1激活NLRP3炎性体的分子机制及相关信号通路的节点蛋白在AS中的作用,以期为研究AS发病机制和防治策略提供新思路。

二甲双胍抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠NLRP3炎性体相关蛋白表达并减轻其炎症

目的探讨二甲双胍(MET)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠含pyrin结构域寡核苷酸结合结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)炎性体的调节作用。方法建立EAE小鼠模型同时设正常阴性对照组,在免疫的第14天(小鼠开始出现神经功能缺损),将建模小鼠随机分成EAE组和MET处理组,MET处理组腹腔注射MET,剂量为200 mg/kg,持续给药11 d,模型组及正常阴性对照组腹腔注射等体积PBS。观察小鼠药物干预前后临床评分,免疫组织化学染色观察脊髓病变部位NLRP3、胱天蛋白酶1(caspase-1)、含胱天蛋白酶激活和募集结构域凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的表达情况;HE染色观察脊髓炎症细胞浸润、固蓝(FB)染色观察髓鞘脱失的情况;ELISA检测血清中促炎因子白细胞介素18(IL-18)和抑炎因子IL-10的水平。结果与EAE组相比,MET处理组临床评分显著降低,脊髓组织浸润的炎细胞减少,脱髓鞘明显改善;NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表达显著减少;与正常组相比,EAE组IL-18表达明显增加,IL-10表达量下降;而MET处理组IL-18表达量下降,IL-10表达量增加。结论MET抑制NLRP3炎性体相关蛋白的表达,抑制炎症因子的释放,减轻EAE小鼠的炎症反应。

右美托咪定对劳力性热射病大鼠相关性横纹肌溶解的缓解及其机制

目的观察右美托咪定(DEX)可否通过激活肾上腺素能α_(2)受体(ADRA2A)缓解劳力性热射病(EHS)大鼠横纹肌溶解(RM),并基于活性氧(ROS)/含Pyrin结构域NOD样蛋白3(NLRP3)/白细胞介素(IL)-1β通路探索其潜在机制。方法将适应性训练7 d后的36只雄性SD大鼠随机分为6组:对照组(CN组)、EHS组、低DEX剂量组(EHS+低DEX组)、高DEX剂量组(EHS+高DEX组)、DEX联合育亨宾(YOH)组(EHS+高DEX+YOH组)、育亨宾组(EHS+YOH组);每组6只。造模前,EHS+高DEX+YOH组和EHS+YOH组腹腔注射YOH 1 mg/kg,其他4组腹腔注射等量生理盐水;造模时,除CN组外,其他5组大鼠均采用高温高湿舱内热运动法构建EHS大鼠模型,造模成功后,EHS+低DEX组大鼠腹腔注射DEX 10μg/kg,EHS+高DEX组和EHS+高DEX+YOH组大鼠腹腔注射DEX 30μg/kg,CN组、EHS组及DEX+YOH组大鼠腹腔注射等量生理盐水。6 h后麻醉,取腹主动脉血及腓肠肌组织。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-1β及肌红蛋白(MB)表达水平,生化试剂盒检测大鼠血清肌酸激酶(CK)水平,HE染色观察大鼠腓肠肌组织病理改变,透射电镜观察腓肠肌超显微结构改变,2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针检测活性氧(ROS)水平,Western blotting检测NLRP3、胱天蛋白酶-1(caspase-1)及肾上腺素能α_(2)受体(ADRA2A)表达水平。结果与CN组比较,EHS组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、CK及MB均明显升高(P<0.01)。HE染色结果显示,EHS组大鼠腓肠肌组织出现纤维结构紊乱、出血、水肿、炎性细胞浸润等病理表现。透射电镜显示,EHS组腓肠肌超微结构出现肌纤维细胞肿胀、体积变大,胞质空泡化,线粒体明显肿胀、脱颗粒、双嵴消失等改变。与CN组比较,EHS组大鼠腓肠肌内ROS、NLRP3、caspase-1水平明显升高(P<0.01);与EHS组比较,EHS+低DEX组、EHS+高DEX组的TNF-α、IL-6、IL-1β、CK、MB及腓肠肌组织内ROS、NLRP3、caspase-1均呈剂量依赖性下降(P<0.05),且HE染色和透射电镜显示病理损伤有所减轻。与EHS+高DEX组比较,EHS+高DEX+YOH组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、CK、MB及腓肠肌组织内ROS、NLRP3、caspase-1均升高(P<0.05),且HE染色和透射电镜显示病理损伤加重。与CN组比较,EHS组大鼠腓肠肌内ADRA2A表达明显下降(P<0.01),EHS+低DEX组和EHS+高DEX组大鼠肌肉中ADRA2A表达较EHS组明显升高(P<0.05)。结论DEX可通过激活ADRA2A减轻EHS诱导的RM,其机制可能与抑制ROS依赖性NLRP3/IL-1β炎性通路有关。

小鼠抗NLRP3单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备小鼠抗含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)的单克隆抗体(mAb)并检测其特异性。方法 将编码小鼠NLRP3基因外显子3(Ms-N3)的基因片段插入载体p36-G3-throhFc中构建重组质粒Ms-N3-throhFc,然后将该质粒转染到HEK293F细胞中,进行真核蛋白表达。进一步利用蛋白A亲和层析柱纯化得到Ms-N3蛋白并免疫NLRP3基因敲除(NLRP3^(-/-))小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞。进而通过ELISA和免疫荧光方法筛选能够分泌特异性识别小鼠NLRP3的mAb的杂交瘤细胞。结果 成功构建Ms-N3-throhFc重组质粒并证明该质粒能在HEK293F细胞中稳定表达。ELISA初步筛选获得12株杂交瘤细胞,经过免疫荧光实验检测发现其中的9-B8-3-2-C5分泌的mAb能够特异性识别非变性的小鼠NLRP3蛋白,该mAb的重链亚型为IgM,轻链亚型为κ。结论 成功获得小鼠抗NLRP3 mAb。