信号转导接头蛋白2和输入蛋白5表达对骨骼肌蛋白质周转的影响

目的探讨信号转导接头蛋白2(STAP2)和输入蛋白5(Ipo5)表达对骨骼肌蛋白质周转的影响。方法 12只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分入对照组(n=6)和模型组(n=6)。对照组不处理,模型组采用阻血诱导大鼠骨骼肌肥大。体外培养两组比目鱼肌细胞,模型组细胞用sh RNA慢病毒感染细胞,先后实现基因STAP2、Ipo5沉默、过表达和功能挽救。Western blotting检测两组细胞STAP2、Ipo5和myostatin蛋白表达。结果模型组较对照组STAP2表达显著上升(t=-11.786,P<0.001),Ipo5和myostatin表达下降(t>14.039,P<0.001);在对照组、模型组、沉默组、过表达组、挽救组中,myostatin表达随STAP2表达降低而升高,随Ipo5表达升高而升高。结论 STAP2表达上调和Ipo5表达下降可促进蛋白质合成。

棕榈酰化修饰的NOD_(2)在失血性休克动物模型中的作用

目的探讨核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD_(2))在失血性休克及缺血再灌注时对肺损伤的作用及机制。方法10只NOD_(2)基因敲除SD大鼠,经失血性休克模型制备后设为对照组(复苏初期予以生理盐水)。30只普通SD大鼠经失血性休克动物模型制备后,按随机数字表法分为3组:空白组(复苏初期予以生理盐水)、棕榈酰化修饰酶(PAT)抗体组(anti-PAT组,复苏初期予以PAT抗体)及NOD_(2)抗体组(anti-NOD_(2)组,复苏初期予以NOD_(2)抗体),每组10只。经复苏24 h采集血液标本后将其处死并采集肺组织。在实验开始、休克初期及再灌注后2 h分别进行血气分析。检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6及肺组织丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)水平。免疫印迹法检测肺组织胞核高迁移率族蛋白B(HMGB1)、棕榈酰化转移蛋白(ZDHHC5)及NOD_(2)表达水平。荧光显微镜及光镜下观察肺组织病理切片。结果240 min时空白组氧分压[p(O2)]明显低于其他3组(P<0.05);30 min及240 min时空白组乳酸水平高于其他3组(P<0.05)。空白组TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA及MPO水平最高(P<0.05),且对照组低于anti-PAT组和anti-NOD_(2)组。空白组HMGB1、NOD_(2)和ZDHHC5表达量最高(P<0.05),且对照组HMGB1和NOD_(2)表达量低于anti-PAT组和anti-NOD_(2)组(P<0.05)。空白组棕榈酰化修饰的NOD_(2)的免疫荧光表达量明显高于对照组、anti-PAT组及anti-NOD_(2)组。空白组较对照组、anti-PAT组及anti-NOD_(2)组肺泡内皮及肺泡组织破坏明显,炎性细胞浸润明显。结论在失血性休克及缺血再灌注动物模型中,NOD_(2)在ZDHHC5的调控下产生棕榈酰化修饰的NOD_(2),从而促使TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA及MPO的释放,损伤肺组织。

硫化氢通过Nod2信号通路在肾脏缺血再灌注中保护作用的研究

目的探讨硫化氢(H_2S)在Nod2信号通路中对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法健康雄性Wistar大鼠40只,体质量180~220 g,随机分为4组:假手术组(sham组)、肾脏缺血再灌注组(IRI组)、IRI+胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)抑制剂炔丙基甘氨酸PAG组(IRI+PAG组)、IRI+胱硫醚-β-合成酶(CBS)抑制剂羟胺HA组(IRI+HA组)。大鼠右肾切除后,Sham组:分离左肾动脉,24 h后提取肾组织标本;IRI组:夹闭左侧肾蒂45 min后再灌注24 h后留取肾组织标本;IRI+PAG组:从左肾动脉插管,将CSE抑制剂PAG以2μmol/min的速度注入左肾动脉,给药20 min,停药5 min;IRI+HA组:从左肾动脉插管,将CBS抑制剂HA以300μmol/min的速度注入左肾动脉,给药20 min,停药5 min,以上2组同IRI组方法制作缺血性AKI模型,留取肾组织标本。蛋白印迹法检测肾组织核苷酸结合寡聚物结构域Nod2及细胞核因子KB蛋白的表达,实时定量PCR法检测Nod2mRNA的表达。免疫组织化学法检测肾组织白细胞介素-1(IL-1β)的表达;HE染色观察肾组织学改变。结果与Sham组比较,IRI组大鼠肾组织Nod2蛋白、NF-κB(p65)、(IL-1β)等蛋白增加(P<0.05),Nod2mRNA表达显著增加(P<0.05),HE染色表现为急性肾小管坏死;IRI+PAG、IRI+HA组组大鼠肾组织Nod2蛋白、NF-κB、IL-Iβ等与IR组比较明显增加(P<0.05),HE染色病理损伤加重。结论 H_2S可以抑制Nod2信号通路的激活减轻炎症反应从而减轻肾损伤。

NOD2、TNF-α、MMP-9及Caspase-3在胎膜早破发病中的作用及意义

目的探讨胎膜早破患者胎膜组织核苷酸结合寡聚化结构域受体2(NOD2)与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、活化型Caspase-3蛋白及羊水中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平表达的相关性,为进一步了解胎膜早破的病因学及治疗途径提供新思路。方法选择足月胎膜早破、未足月胎膜早破、正常妊娠晚期妇女各30例,应用免疫组织化学染色法及蛋白印迹技术检测各组胎膜组织NOD2、MMP-9及活化型Caspase-3的蛋白表达部位及水平,ELISA法检测羊水中TNF-α水平,并分析四者表达的相关性。结果胎膜早破组胎膜组织NOD2、MMP-9、活化型Caspase-3表达及羊水TNF-α水平高于正常妊娠晚期组(P<0.05),未足月胎膜早破组NOD2表达及羊水TNF-α水平高于足月胎膜早破组(P<0.05),MMP-9及活化型Caspase-3在足月胎膜早破组胎膜组织中的表达与未足月胎膜早破组相比差异无统计学意义。胎膜组织中NOD2表达水平与羊水TNF-α水平、胎膜组织中MMP-9及活化型Caspase-3的表达呈正相关(均P<0.01)。结论 NOD2、TNF-α、MMP-9、活化型Caspase-3表达水平升高与胎膜早破的发生相关;四者在胎膜早破发病机制中存在关联。

烫伤后脓毒症大鼠肺组织炎症反应和自噬与NOD2信号通路的关系

目的评价烫伤后脓毒症大鼠肺组织炎症反应和自噬与Nod样受体2（NOD2）信号通路的关系。方法SPF级健康雄性SD大鼠20只，体重200～250 g，采用随机数字表法分为2组（n＝10）：对照组（C组）和烫伤后脓毒症组（SS组）。于20%总体表面积Ⅲ度烫伤（背部皮肤浸入99～100 ℃热水中，持续12 s）后24 h静脉注射胞壁酰二肽5 mg/kg的方法制备烫伤后脓毒症模型。C组于20 ℃水中假烫伤后24 h静脉注射生理盐水1 ml。SS组于静脉注射胞壁酰二肽后6 h、C组于注射生理盐水后6 h时，取动脉血标本，采用ELISA法检测血清TNF-α和IL-6浓度，随后取肺组织，测定髓过氧化物酶（MPO）活性，采用RT-PCR法检测肺组织NOD 2 mRNA的表达，采用Western blot法检测受体相互作用蛋白-2（RICK）、NF-κBp65和微管相关蛋白1轻链3Ⅰ和Ⅱ（LC3Ⅰ、LC3Ⅱ）的表达。计算LC3Ⅰ与LC3Ⅱ的比值（LC3Ⅰ/Ⅱ）。结果与C组比较，SS组肺组织NOD2 mRNA、RICK、NF-κBp65表达上调，LC3Ⅰ/Ⅱ、血清TNF-α和IL-6浓度升高（P〈0.05）。结论大鼠烫伤后脓毒症时肺组织炎症反应和自噬水平增强的机制可能与NOD2信号通路激活有关。

NOD1和NOD2基因多态性与胃癌遗传易感性的研究

目的探索NOD1和NOD2功能性单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）位点与胃癌易感性的关系。方法采用病例对照研究设计,比较病例组与对照组先天免疫反应信号通路相关基因NOD1和NOD2功能SNPs的频率差异。结果携带NOD1 rs2906766 C等位基因,可显著增加60岁及以上的个体（调整OR=1.30,95%CI=1.02-1.65）、吸烟者（调整OR=1.38,95%CI=1.05-1.82）和H.pylori阴性者（调整OR=1.36,95%CI=1.03-1.79）发生胃癌的风险,但没有发现NOD2 rs3135500位点A〉G的改变与中国人群胃癌的发生有关联。结论 NOD1基因rs2906766位点C〉T的改变与中国人群胃癌的遗传易感性有关联,但需要在更大样本中验证这一结果,并开展功能学研究以揭示其潜在的生物学机制。

乙酰胆碱受体对胞壁酰二肽激活小鼠巨噬细胞NLR2/RIP2通路的调控作用

目的 评价乙酰胆碱受体对胞壁酰二肽（MDP）激活小鼠巨噬细胞Nod样受体2/受体相互作用蛋白2（NLR2/RIP2）通路的调控作用.方法 RAW264.7细胞长至对数生长期时,接种于12孔培养板（细胞密度1＆#215;106个/ml,2 ml/孔）,108个培养孔.采用随机数字表法,将其分为3组（n=36）,正常对照组（C组）常规培养;M组加入MDP,终浓度为10 μg/ml;G组同时加入MDP和α7烟碱型乙酰胆碱受体特异性激动剂GTS-21,终浓度分别为10、50 μg/ml.分别于MDP孵育1、6、24h时取12个培养孔,取细胞悬液,采用实时荧光定量PCR法检测NLR2 mRNA表达,采用Western blot印迹法检测RIP2表达,采用ELISA法检测培养液TNF-α和高迁移率族蛋白-1（HMGB1）的浓度.结果 与C组比较,M组不同时点NLR2 mRNA、RIP2、TNF-α和HMGB1的水平升高（P＜0.05）;与M组比较,G组不同时点NLR2 mRNA、RIP2、TNF-α和HMGB1的水平降低（P＜0.05）.结论 乙酰胆碱受体可抑制MDP激活小鼠巨噬细胞NLR2/RIP2通路转导.

NOD2调控Snail表达在糖尿病肾病足细胞上皮-间质转分化中的作用

目的观察高糖环境中足细胞核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2（NOD2）、上皮-间质转分化（EMT）相关蛋白的表达，探讨NOD2参与EMT的分子机制。方法常规方法培养人肾小球足细胞，高糖刺激后细胞免疫荧光法检测EMT相关蛋白仪平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、nephrin的表达；实时荧光定量PCR和Western印迹法检测NOD2、锌指转录因子（Snail）和足细胞EMT相关蛋白α—SMA、结蛋白（Desmin）、上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）及Nephrin的表达。shRNA干扰NOD2表达后再给予高糖刺激细胞，Western印迹法检测Snail及后续EMT相关蛋白的表达情况。用shRNA干扰Snail表达后，胞壁酰二肽（MDP）活化NOD2，Western印迹法检测E-cadherin、Nephrin、Desmin、α—SMA的表达。结果高糖刺激24h后，与正常对照组相比，高糖组NOD2、SnailmRNA和蛋白的表达明显增加；上皮表型蛋白E—cadherin、NephrinmRNA和蛋白的表达下调，间质表型蛋白Desmin、α-SMAmRNA和蛋白的表达上调（均P〈0．05）；高渗对照组无明显变化。干扰NOD2表达后，Snail及EMT相关蛋白表达异常均得到恢复，与高糖组相比差异有统计学意义（均P〈0．05）。与MDP组相比，MDP＋shRNA-Snail组细胞E—cadhefin、Nephrin蛋白的表达明显增加；Desmin、α—SMA表达明显减少（均P〈0．05）。结论高糖可诱导足细胞NOD2表达，并通过上调Snail表达促进足细胞上皮一间质转分化。以NOD2／Snail／EMT通路为靶点的基因干预可减轻高糖引起的足细胞损伤，可能为糖尿病肾病的治疗提供新思路。

背根神经节NOD2在大鼠神经病理性痛形成中的作用

目的评价背根神经节核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(NOD2)在大鼠神经病理性痛形成中的作用。方法成年雄性SPF级SD大鼠32只,体重240~260 g,2~3月龄,采用随机数字表法分为4组(n=8):对照组(C组)、神经病理性痛组(NP组)、阴性对照siRNA组(N组)和NOD2-siRNA组(R组)。N组鞘内注射1×10^(8) IFU/ml阴性对照siRNA 10μl,R组鞘内注射1×10^(8) IFU/ml NOD2-siRNA 10μl,连续鞘内注射3 d,1次/d。于鞘内注射后2周,采用坐骨神经选择性损伤(SNI)法制备神经病理性痛模型。于SNI前1 d、SNI后1、3、7、10、14和28 d时测定机械缩足反应阈(MWT)。于末次行为学测定结束后,处死大鼠,取L4-6背根神经节组织,采用Western blot法测定NOD2的表达,实时定量PCR法测定TNF-α、IL-1β、IL-6、NOD2的mRNA表达。结果与C组比较,NP组SNI后各时点MWT降低,背根神经节NOD2及其mRNA、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达上调(P<0.01);与NP组比较,R组SNI后各时点MWT升高,背根神经节NOD2及其mRNA、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达下调(P<0.01),N组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论大鼠神经病理性痛形成的机制可能与背根神经节NOD2表达上调,进而上调促炎因子表达有关。

胞壁酰二肽对人牙髓细胞分化影响的研究

目的探讨天然免疫受体核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2（nucleotide—binding oligomerization domain-2，NOD-2）在深龋牙髓组织中的表达及NOD-2特异性配体胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）对人牙髓细胞分化的影响。方法实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测深龋及健康人牙髓组织中NOD-2表达差异；1mg／LMDP刺激体外培养的人牙髓细胞0、2、6、12、24h，实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹法及免疫荧光检测NOD-2基因及蛋白表达；不同质量浓度MDP刺激人牙髓细胞24h，蛋白质免疫印迹法检测24h后牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）的表达；0．1mg／LMDP作用于人牙髓细胞0、2、6、12、24h，检测不同时间点牙本质涎磷蛋白（sialophosphoprotin，DSPP）、骨钙蛋白mRNA及骨桥蛋白的表达。结果深龋牙髓组织中NOD-2mRNA相对表达量为（0．2610±0．0824），较健康牙髓组织（0．0024±0．0002）显著增高（P〈0．05）。实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法结果显示NOD-2表达随时间上调，免疫荧光检测证实NOD-2蛋白表达于胞质。MDP质量浓度为0．1mg／L时DSP蛋白表达量最大（0．3782±0．0564），并随MDP质量浓度增加而下降；DSPP、骨钙蛋白mRNA表达呈时间依赖性，12h达最大值，24h后有所下降；骨桥蛋白表达量随时间上调。结论深龋牙髓组织中NOD-2表达升高，MDP与人牙髓细胞的分化相关。