血塞通注射液及NEP1-40对脑梗死大鼠大脑皮层及血清炎症因子表达的影响

目的:分析血塞通注射液及Nogo胞外肽端残基1-40(NEP1-40)对SD大鼠脑梗死大脑皮层及血清中促炎因子与抑炎因子表达的影响。方法:25只雄性健康SD大鼠,依据随机数字表法分成模型组、NEP1-40组、血塞通组、假手术组及NEP1-40联合血塞通组(P+N组),每组5只。依据改良Longa线栓栓塞法建立脑梗死模型,各给药组分别给予相应药物,干预28天后处死大鼠,观察大鼠术后体质量和神经功能评分改变状况及血清、脑组织内白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素-10(IL-10)的水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠术后7、14、28天体质量明显下降;神经功能评分明显上升;血清TNF-α、TGF-β1含量上升,IL-10含量下降;脑组织TNF-α、IL-1β、TGF-β1蛋白表达上升,IL-10蛋白表达下降;差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,NEP1-40组、血塞通组及P+N组大鼠术后7、14、28天体质量显著上升,神经功能评分明显下降,血清TNF-α含量下降,IL-10含量上升;P+N组大鼠血清IL-β1含量下降;血塞通组及P+N组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β蛋白表达下降,TGF-β1、IL-10蛋白表达上升;NEP1-40组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β蛋白表达下降,IL-10蛋白表达上升;差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:血塞通注射液及NEP1-40通过调整促炎、抑炎因子表达来加快脑梗死大鼠神经功能恢复。

勿动蛋白A胞外肽残基1-40修饰神经干细胞促进轴突再生

目的构建勿动蛋白A胞外肽残基1-40(NEP1-40)基因工程神经干细胞(NEP1-40-NSCs)并探究其对神经元轴突再生的影响。方法制备NEP1-40-NSCs,检测目的基因的表达量,同时鉴定其分化潜能;NEP1-40-NSCs组与神经干细胞(NSCs)组分别与大鼠海马组织神经元共培养后测量各组神经元轴突新增面积,同时鬼笔环肽染色观察生长锥及丝状伪足结构。多组间比较用单因素方差分析,两组间比较用t检验。结果NEP1-40-NSCs组β3-微管蛋白(Tuj-1)、少突胶质细胞转录因子2(Oligo2)及髓鞘碱性蛋白(MBP)所标记的阳性细胞数高于NSCs组(47.001±16.670比30.333±3.480、38.001±14.001比24.000±2.582、16.464±0.813比12.334±0.681,t=4.789、5.422、6.745,P<0.05),而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)标记的阳性细胞数低于NSCs组(22.002±20.331比42.330±3.575,t=5.688,P<0.05)。NEP1-40-NSCs组的轴突新增面积大于NSCs组[(9096.000±4292.000)μm2比(4803.000±541.300)μm2,t=7.929,P<0.05];鬼笔环肽染色结果显示与NSCs组比较,NEP1-40-NSCs组的生长锥面积增宽[(103.000±79.670)μm2比(23.330±8.192)μm2,t=9.725,P<0.05],伪足数量增多且长度增加[(0.122±0.037)μm比(0.085±0.008)μm,t=4.513,P<0.05]。结论NEP1-40-NSCs在体外能够促进神经元轴突的延长,影响生长锥的结构发育,具有促进脊髓损伤修复的潜力。

慢病毒介导NEP1-40及NT-3双基因转染神经干细胞的实验研究

目的通过慢病毒载体将NEP1-40(Nogo extracellular peptide residues 1-40)及神经营养因子_3(neurotrophin 3,NT-3)双基因转染入神经干细胞(neural stem cells,NSC_s)内进行表达,探讨NEP1-40及NT-3双基因转染NSC_s的可行性,为NSC_s体内实验奠定基础。方法将SD大鼠胚胎室管膜区NSC_s采用空载慢病毒载体(A组)、NEP1-40慢病毒载体(B组)、NT-3慢病毒载体(C组)及NEP1-40和NT-3慢病毒载体(D组)进行转染,以未转染病毒的细胞作为对照组(E组)。用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为5、10、15的慢病毒载体分别转染24、48、72 h,荧光显微镜观察转染后细胞内荧光表达情况,确定慢病毒载体的最佳MOI和收样时间。再分别通过实时荧光定量PCR及Western blot,检测转染后细胞中NEP1-40及NT-3基因的表达,以及细胞和培养基中NEP1-40及NT-3蛋白的表达。结果荧光显微镜观察示,MOI为10时NEP1-40和NT-3基因慢病毒载体在NSC_s内转染率最高,最佳时间为转染48 h时。实时荧光定量PCR及Western blot检测示,B、D组NEP1-40 m RNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、C组,差异有统计学意义(P<0.05);A、C组间及B、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。C、D组NT-3 m RNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、B组,差异有统计学意义(P<0.05);A、B组间和C、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论通过慢病毒载体可将NEP1-40及NT-3双基因成功转染入NSC_s内,在NSC_s内稳定表达,且两种目的基因在表达过程中无相互拮抗或促进作用。

NEP1-40基因修饰对神经干细胞移植后存活和分化的影响

目的探讨NEP1-40(Nogo extracellular peptide residues 1-40)基因修饰对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植后存活和分化的影响。方法从孕18 d Wistar大鼠胚胎大脑皮质中分离获得原代NSCs并进行体外培养。采用慢病毒载体将NEP1-40基因导入第3代NSCs内完成NEP1-40基因修饰。将30只成年雌性SD大鼠在T9水平进行脊髓右侧半切后随机分为脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)组(B组)、NSCs移植组(C组)、NEP1-40基因修饰NSCs组(D组),每组各10只,伤后7 d在损伤局部分别植入NSCs基础培养基、NSCs悬液及NEP1-40基因修饰的NSCs;另取10只SD大鼠仅行T9椎板切除设为假手术组(A组)。移植后8周,取损伤段脊髓组织行辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)神经示踪、巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色及神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF-200)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein,GFAP)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)免疫组织化学染色,评价神经纤维再生情况及移植细胞存活和分化情况。结果移植后8周,A、B、C、D组HRP阳性染色神经纤维束分别为(85.17±6.97)、(12.17±2.79)、(33.58±5.47)、(59.25±7.75)个,B、C、D组显著少于A组(P<0.01);但C、D组显著高于B组,D组显著高于C组,差异均有统计学意义(P<0.01)。Nestin免疫荧光染色示,A组未见明显Nestin荧光信号,B组仅可见少量散在荧光信号,C、D组有较强荧光信号。免疫组织化学染色定量分析示,NF-200阳性细胞数及MBP积分吸光度(IA)值A组最高,D组次之,C组较少,B组最少,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);GFAP阳性细胞数B组最多,D组次之,C组较少,A组最少,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);C、D组间NF-200、GFAP、MBP阳性细胞百分比比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 NEP1-40基因修饰对NSCs移植后的分化无明显诱导性,但能促进移植细胞存活、分化及神经元轴突再生,为研究NSCs移植治疗SCI提供了新思路。

NEP1-40基因慢病毒载体构建及鉴定

目的构建NEP1-40(Nogo extra cellular peptide residues 1-40)基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞奠定基础,并实现在细胞中高效、稳定表达。方法从含有NEP1-40基因的cDNA文库中,利用PCR方法钓取NEP1-40基因编码区片段。将目的基因与酶切线性化的载体pGC-FU进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的目的质粒。将构建成功的目的质粒和两种辅助包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,荧光显微镜下观察慢病毒转染293T细胞后荧光表达情况,采用Western blot检测NEP1-40及绿色荧光蛋白融合蛋白表达情况。结果 PCR产物经电泳分析表明成功获取NEP1-40基因cDNA克隆,测序提示慢病毒转染质粒连接构建正确;荧光表达检测显示293T细胞中产生慢病毒颗粒;Western blot显示NEP1-40在细胞内稳定表达。结论成功构建NEP140基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞后从分子水平探讨NEP1-40基因功能奠定了实验基础。

NEP1-40和NT-3基因共转染施万细胞来源外泌体对神经干细胞存活与分化的影响

目的 观察Nogo胞外肽端残基1-40(Nogo extracellular peptide residues 1-40,NEP1-40)和神经营养因子3(neurotrophin 3,NT-3)基因共转染施万细胞来源外泌体(Schwann cell-derived exosome,SCDE)对神经干细胞(neural stem cell,NSC)存活与分化的影响,为SCDE与NSC共移植的体内试验奠定基础。方法 通过慢病毒载体将NEP1-40及NT-3双基因转染入施万细胞,收集SCDE进行鉴定。选取传代3次的NSC,将其接种到接种板中,分为常规培养组、单纯外泌体培养组(加入空载质粒修饰SCDE进行培养)和双基因外泌体培养组(加入双基因修饰SCDE进行培养)。检测各组细胞的活性,并通过免疫荧光检测神经元特异核蛋白(neuronal nuclei,NeuN)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和半乳糖神经酰胺酶(galactosylceramidase,GALC)阳性的细胞来评价NSC的存活与分化情况。结果 双基因转染后荧光强度均较高且细胞状态较好。双基因组NEP1-40和NT-3的信使RNA和蛋白相对表达水平均高于空载质粒组(P<0.05)。双基因组SCDE中NEP1-40和NT-3的蛋白相对表达水平均高于空载质粒组(P<0.05),两组的SCDE中CD63的蛋白相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。细胞活性方面,双基因外泌体培养组细胞活性最强,单纯外泌体培养组次之,常规培养组最弱,组间两两比较差异有统计学意义(1.28±0.04 vs. 0.72±0.09 vs. 0.41±0.04,P<0.05)。细胞存活情况方面,双基因外泌体培养组的NeuN阳性细胞(5.23±0.22 vs. 2.36±0.09 vs. 1.00±0.01)和GALC阳性细胞(2.29±0.06 vs.1.75±0.02 vs.1.00±0.04)存活情况最佳,单纯外泌体培养组次之,常规培养组最差,组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05);常规培养组的GFAP阳性细胞存活情况最佳,单纯外泌体培养组次之,双基因外泌体培养组最差(1.00±0.04 vs. 0.52±0.04 vs. 0.30±0.01),组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。细胞分化情况方面,双基因外泌体培养组的NeuN阳性细胞(0.44±0.02 vs. 0.29±0.01 vs. 0.16±0.01)和GALC阳性细胞(0.38±0.07 vs. 0.23±0.02 vs.0.12±0.01)分化情况最佳,单纯外泌体培养组次之,常规培养组最差,组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05);常规培养组的GFAP阳性细胞分化情况最佳,单纯外泌体培养组次之,双基因外泌体培养组最差(0.52±0.05 vs.0.42±0.03 vs. 0.30±0.09),组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 通过慢病毒载体可将NEP1-40及NT-3双基因成功转染入施万细胞,能有效提高SCDE中相关蛋白含量,且该外泌体在体外能有效促进NSC的存活与分化。