血塞通注射液及NEP1-40对脑梗死大鼠大脑皮层及血清炎症因子表达的影响

目的:分析血塞通注射液及Nogo胞外肽端残基1-40(NEP1-40)对SD大鼠脑梗死大脑皮层及血清中促炎因子与抑炎因子表达的影响。方法:25只雄性健康SD大鼠,依据随机数字表法分成模型组、NEP1-40组、血塞通组、假手术组及NEP1-40联合血塞通组(P+N组),每组5只。依据改良Longa线栓栓塞法建立脑梗死模型,各给药组分别给予相应药物,干预28天后处死大鼠,观察大鼠术后体质量和神经功能评分改变状况及血清、脑组织内白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素-10(IL-10)的水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠术后7、14、28天体质量明显下降;神经功能评分明显上升;血清TNF-α、TGF-β1含量上升,IL-10含量下降;脑组织TNF-α、IL-1β、TGF-β1蛋白表达上升,IL-10蛋白表达下降;差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,NEP1-40组、血塞通组及P+N组大鼠术后7、14、28天体质量显著上升,神经功能评分明显下降,血清TNF-α含量下降,IL-10含量上升;P+N组大鼠血清IL-β1含量下降;血塞通组及P+N组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β蛋白表达下降,TGF-β1、IL-10蛋白表达上升;NEP1-40组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β蛋白表达下降,IL-10蛋白表达上升;差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:血塞通注射液及NEP1-40通过调整促炎、抑炎因子表达来加快脑梗死大鼠神经功能恢复。

勿动蛋白A胞外肽残基1-40修饰神经干细胞促进轴突再生

目的构建勿动蛋白A胞外肽残基1-40(NEP1-40)基因工程神经干细胞(NEP1-40-NSCs)并探究其对神经元轴突再生的影响。方法制备NEP1-40-NSCs,检测目的基因的表达量,同时鉴定其分化潜能;NEP1-40-NSCs组与神经干细胞(NSCs)组分别与大鼠海马组织神经元共培养后测量各组神经元轴突新增面积,同时鬼笔环肽染色观察生长锥及丝状伪足结构。多组间比较用单因素方差分析,两组间比较用t检验。结果NEP1-40-NSCs组β3-微管蛋白(Tuj-1)、少突胶质细胞转录因子2(Oligo2)及髓鞘碱性蛋白(MBP)所标记的阳性细胞数高于NSCs组(47.001±16.670比30.333±3.480、38.001±14.001比24.000±2.582、16.464±0.813比12.334±0.681,t=4.789、5.422、6.745,P<0.05),而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)标记的阳性细胞数低于NSCs组(22.002±20.331比42.330±3.575,t=5.688,P<0.05)。NEP1-40-NSCs组的轴突新增面积大于NSCs组[(9096.000±4292.000)μm2比(4803.000±541.300)μm2,t=7.929,P<0.05];鬼笔环肽染色结果显示与NSCs组比较,NEP1-40-NSCs组的生长锥面积增宽[(103.000±79.670)μm2比(23.330±8.192)μm2,t=9.725,P<0.05],伪足数量增多且长度增加[(0.122±0.037)μm比(0.085±0.008)μm,t=4.513,P<0.05]。结论NEP1-40-NSCs在体外能够促进神经元轴突的延长,影响生长锥的结构发育,具有促进脊髓损伤修复的潜力。

NEP1-40和NT-3基因共转染施万细胞来源外泌体对神经干细胞存活与分化的影响

目的 观察Nogo胞外肽端残基1-40(Nogo extracellular peptide residues 1-40,NEP1-40)和神经营养因子3(neurotrophin 3,NT-3)基因共转染施万细胞来源外泌体(Schwann cell-derived exosome,SCDE)对神经干细胞(neural stem cell,NSC)存活与分化的影响,为SCDE与NSC共移植的体内试验奠定基础。方法 通过慢病毒载体将NEP1-40及NT-3双基因转染入施万细胞,收集SCDE进行鉴定。选取传代3次的NSC,将其接种到接种板中,分为常规培养组、单纯外泌体培养组(加入空载质粒修饰SCDE进行培养)和双基因外泌体培养组(加入双基因修饰SCDE进行培养)。检测各组细胞的活性,并通过免疫荧光检测神经元特异核蛋白(neuronal nuclei,NeuN)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和半乳糖神经酰胺酶(galactosylceramidase,GALC)阳性的细胞来评价NSC的存活与分化情况。结果 双基因转染后荧光强度均较高且细胞状态较好。双基因组NEP1-40和NT-3的信使RNA和蛋白相对表达水平均高于空载质粒组(P<0.05)。双基因组SCDE中NEP1-40和NT-3的蛋白相对表达水平均高于空载质粒组(P<0.05),两组的SCDE中CD63的蛋白相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。细胞活性方面,双基因外泌体培养组细胞活性最强,单纯外泌体培养组次之,常规培养组最弱,组间两两比较差异有统计学意义(1.28±0.04 vs. 0.72±0.09 vs. 0.41±0.04,P<0.05)。细胞存活情况方面,双基因外泌体培养组的NeuN阳性细胞(5.23±0.22 vs. 2.36±0.09 vs. 1.00±0.01)和GALC阳性细胞(2.29±0.06 vs.1.75±0.02 vs.1.00±0.04)存活情况最佳,单纯外泌体培养组次之,常规培养组最差,组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05);常规培养组的GFAP阳性细胞存活情况最佳,单纯外泌体培养组次之,双基因外泌体培养组最差(1.00±0.04 vs. 0.52±0.04 vs. 0.30±0.01),组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。细胞分化情况方面,双基因外泌体培养组的NeuN阳性细胞(0.44±0.02 vs. 0.29±0.01 vs. 0.16±0.01)和GALC阳性细胞(0.38±0.07 vs. 0.23±0.02 vs.0.12±0.01)分化情况最佳,单纯外泌体培养组次之,常规培养组最差,组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05);常规培养组的GFAP阳性细胞分化情况最佳,单纯外泌体培养组次之,双基因外泌体培养组最差(0.52±0.05 vs.0.42±0.03 vs. 0.30±0.09),组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 通过慢病毒载体可将NEP1-40及NT-3双基因成功转染入施万细胞,能有效提高SCDE中相关蛋白含量,且该外泌体在体外能有效促进NSC的存活与分化。