非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫刺激雏鸡脾脏的转录组学分析

【目的】探究非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(NRTUAs)感染雏鸡脾脏的转录组学变化,明确NRTUAs对雏鸡脾脏先天性免疫的调节效果,为研发家禽抗弓形虫疫苗提供理论依据。【方法】分别以NRTUAs和磷酸盐缓冲液(PBS)感染14日龄雏鸡,感染后第3 d采集脾脏组织样品进行转录组测序,筛选出NRTUAs组与PBS组间的差异表达基因(DEGs),然后进行GO功能注释、KEGG信号通路富集及蛋白调控网络分析,并通过实时荧光定量PCR验证转录组测序的准确性。【结果】与PBS组相比,从感染NRTUAs的雏鸡脾脏中筛选出499个DEGs(286个为上调DEGs,213个为下调DEGs),且NRTUAs组中上调表达的DEGs多于下调表达的DEGs。GO功能注释分析发现,DEGs注释在生物过程(Biological process,BP)、细胞组分(Cellular component,CC)和分子功能(Molecular function,MF)三大类别的58个功能条目上,主要涉及端粒蛋白定位建立正调控、蛋白稳定、含伴侣蛋白T-复合物、内质网腔、内质网、内质网膜组成部分、纺锤中央区及未折叠蛋白结合等功能条目;KEGG信号通路富集分析显示,DEGs主要富集在内质网蛋白加工通路、RNA转运、细胞周期、钙信号通路、黏着斑、细胞衰老、神经活性配体—受体相互作用、细胞因子—细胞因子受体相互作用通路及氨基酸生物合成等通路中;蛋白互作网络分析结果表明,DEGs编码蛋白PLK1、CCNB1、CDK1、CDC20、CCNA2和NDC1均在细胞周期通路上调表达。实时荧光定量PCR验证结果显示,只有2个DEGs(CXCL12和VPREB3)呈上调表达,其余8个DEGs呈下调表达,与转录组测序结果基本一致。【结论】感染NRTUAs后雏鸡脾脏免疫相关基因表达上调,且多数DEGs富集在内质网蛋白合成与细胞周期等相关信号通路上,脾脏细胞活动明显增强,即通过加快建立细胞连接及启动先天性免疫反应而积极对抗弓形虫入侵。

非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫刺激雏鸡胸腺细胞的转录组学分析

为研究非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(Nonreplicating Toxoplasma uracil auxotrophs,NRTUAs)在转录组水平对雏鸡胸腺的免疫调节作用,本研究以接种NRTUAs虫株3 d的雏鸡为试验对象,利用RNA-seq技术对其胸腺组织进行转录组测序以挖掘其中的差异表达基因(DEGs),进而对得到的DEGs进行GO功能注释、KEGG信号通路富集分析和蛋白互作网络分析。结果表明:1)筛选出964个DEGs,其中517个基因表达上调,447个表达下调。2)通过GO功能注释发现差异基因在生物过程、细胞组分和分子功能三大类别显著富集在免疫应答、防御反应、对外界刺激反应、对刺激反应、细胞外区域、细胞表面等条目。3)KEGG信号通路富集分析发现DEGs显著集中在细胞因子及其受体相互作用、IgA产生的肠道免疫网络、细胞粘附分子、Toll样受体信号通路等通路上。4)通过蛋白互作网络分析发现9个重要的关键分子,其中IL-6和IL-18具有调节细胞分化促进干扰素产生的功能,IRF1和IRF7能够调节巨噬细胞等细胞的活化以及抗原递呈能力,SOCS1能够防止STAT1信号通路异常活跃而导致的过度炎症反应,CCL4、CCR5和CCL20作为趋化因子能够诱导多种免疫细胞浸润炎症区域,CD40能够增强抗原递呈进而调节机体的免疫功能。综上,NRTUAs虫株刺激雏鸡胸腺后,胸腺细胞的增殖活动减弱,T细胞活化以及细胞因子分泌等活动增强,并且IL-6、IL-18、IRF1、IRF7、SOCS1、CCL4、CCR5、CCL20和CD40是NRTUAs虫株调节雏鸡胸腺细胞的重要分子,本研究为深入探讨NRTUAs虫株调节家禽胸腺的先天性免疫反应的分子机制提供了理论依据。

非复制型弓形虫的构建及其对小鼠致病性分析

为研究非复制型弓形虫对小鼠的致病性,利用CRISPR-Cas9技术构建非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(NRTUAs),通过药物和荧光筛选阳性虫株,PCR鉴定,并以噬斑试验鉴定NRTUAs株的表型;将NRTUAs株急性感染小鼠,并以△KU80株处理为感染对照,PBS处理为空白对照,每日记录小鼠的死亡情况,并对各组小鼠器官进行病理组织学观察与分析。结果表明:1)NRTUAs株对乙胺嘧啶和氯霉素耐药,重组同源臂上下游PCR鉴定均为阳性,内源性基因位点缺失PCR鉴定均为阴性;2)NRTUAs株在含有尿嘧啶的培养基中能够生长且产生噬斑,在缺乏尿嘧啶的培养基中不能生长且不产生噬斑;3)NRTUAs感染小鼠后,全部存活,且PBS组小鼠的器官组织学形态一致;△KU80组小鼠全部死亡,且两组小鼠器官出现严重病理变化。综上,本研究成功构建非复制型NRTUAs株,该虫株对小鼠无致死性,且小鼠各器官无病理变化,为NRTUAs作为弓形虫疫苗候选株在家畜养殖中的应用奠定理论基础。

NRTUAs感染对小鼠的组织荷虫量及脾脏细胞因子转录水平的影响

为进一步研究非增殖型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(NRTUAs)对小鼠的致病性,本研究以NRTUAs和Δku80虫株分别感染小鼠,每日检测各组小鼠的组织荷虫量,并检测感染后1~3d脾脏相关细胞因子的转录水平。结果表明:1)NRTUAs感染的小鼠不能在7d内清除虫体,NRTUAs刺激小鼠脾脏上调IL-12、TNF-α和IL-10的表达,并诱导温和的炎症反应;2)Δku80虫株感染的小鼠在感染后6d内死亡,组织荷虫量平均水平高于NRTUAs感染的小鼠,Δku80虫株刺激小鼠脾脏上调IL-12、TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-10的表达,诱导剧烈的炎症反应而导致小鼠死亡。综上,NRTUAs对小鼠的致病性较低,NRTUAs组织荷虫量平均水平低于Δku80组,诱导机体的炎症反应显著轻于Δku80组,为NRTUAs作为畜禽免疫增强剂的开发提供研究基础。

一种非复制尿嘧啶营养缺陷型弓形虫的构建及其表型鉴定

目的构建并验证一种可用作生物免疫治疗载体的非复制尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(NRTUA),并鉴定其表型。方法通过经典的基于同源重组的基因敲除技术构建稳定的NRTUA虫株;构建p-OM1-HXGPRT-OM2、pOM1-OM2和p-UP1-HXGPRT-UP2质粒用于敲除RHΔku80Δhxgprt弓形虫中的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶(OMPDC)基因和尿苷磷酸化酶(UP)基因,并通过电转染的方法转染到RHΔku80Δhxgprt弓形虫中,最后经过药物筛选和极限稀释得到RHΔku80ΔompdcΔup::HXGPRT弓形虫(NRTUA虫株)。利用PCR实验和全基因组测序对其进行基因结构验证,然后通过噬斑实验鉴定NRTUA虫株的细胞表型,并通过NRTUA虫株感染小鼠的毒力实验检测其在正常小鼠体内的毒性。结果p-OM1-HXGPRT-OM2、p-OM1-OM2和p-UP1-HXGPRT-UP2质粒进行酶切鉴定,经Nde I酶切后,三种质粒酶切后的骨架DNA片段均为3.0 kb左右。RHΔku80Δompdc::HXGPRT弓形虫和RHΔku80ΔompdcΔhxgprt弓形虫中OMPDC基因被敲除;而RHΔku80ΔompdcΔup::HXGPRT弓形虫中OMPDC基因和UP基因均被敲除。其中敲除的OMPDC基因序列为3.3 kb左右,敲除的UP基因序列为3.1 kb左右,与理论值相吻合。成功构建并通过全基因组测序验证了弓形虫NRTUA株,噬斑实验显示NRTUA虫株在未添加尿嘧啶的培养基中没有噬斑形成,在添加尿嘧啶的培养基中能产生噬斑。小鼠毒力实验中,活的NRTUA虫株感染小鼠后直到实验周期结束无小鼠死亡,对照原株弓形虫感染小鼠后从第7~9天所有小鼠均死亡。结论NRTUA虫株在体外尿嘧啶缺乏的条件下无法在宿主细胞内增殖且在正常小鼠体内不具有致死毒性,是一种减毒甚至基本无毒的弓形虫活疫苗,具有作为生物免疫治疗载体的应用潜力。

弓形虫非复制型尿嘧啶营养缺陷型疫苗株对肿瘤的免疫治疗作用

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种单细胞寄生原虫,入侵机体后可诱导机体产生抗弓形虫免疫应答,这种免疫应答与抗肿瘤免疫应答有相似之处。近年的研究发现,弓形虫非复制型尿嘧啶营养缺陷型疫苗株(nonreplicating avirulent uracil auxotroph vaccine strain,cps)能有效地抑制多种实体瘤的进展。本文就弓形虫cps株对小鼠卵巢癌、胰腺癌和黑色素瘤的免疫治疗进展进行综述,以期为个体化癌症免疫治疗提供有价值的参考。