Nonomuraea candida HMC10^(T)中新结构套索肽noncaromin生物合成基因簇的克隆及异源表达

【目的】本研究旨在通过定向克隆菌株Nonomuraea candida HMC10^(T)中一个新的Ⅱ型套索肽类生物合成基因簇,通过在放线菌底盘宿主中的异源表达,获得新结构套索肽noncaromin,并完成其抑菌活性分析。【方法】通过anti SMASH软件分析菌株N.candida HMC10^(T)全基因组序列,确定新的Ⅱ型套索肽noncaromin的生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster of noncaromin,nonc-BGC)。然后,利用ExoCET重组技术(exonuclease combined with RecET recombination)获得完整的nonc-BGC,得到重组质粒pJQK652,并通过λ-Red重组技术改造得到整合型质粒pJQK653。采用接合转移方法,将该质粒分别导入白色链霉菌、2株变铅青链霉菌、2株天蓝色链霉菌和红色糖多孢菌宿主中进行异源表达,再通过发酵和分离纯化获得目标套索肽noncaromin。最后,利用QTOF-ESI-MS^(2)完成套索肽noncaromin的结构鉴定,并通过抗菌活性检测确定该化合物的生物活性。【结果】本研究利用ExoCET技术成功获得了完整的nonc-BGC,在6种放线菌宿主中成功异源表达,完成了noncaromin的结构鉴定,确定了其具有微弱的抗枯草芽孢杆菌活性。【结论】本研究在克隆得到新结构套索肽nonc-BGC的基础上,实现了该基因簇在6个放线菌底盘宿主中的成功表达,获得了1个具有微弱抑制枯草芽孢杆菌活性的新结构Ⅱ型套索肽noncaromin。本研究结果为发掘菌株N.candida HMC10~T及其他放线菌中的新结构化合物提供了借鉴。

野野村放线菌DB-3-04产达巴万星前体A-40926 B_(0)发酵培养基优化

目的优化野野村放线菌产达巴万星前体A-40926 B_(0)的发酵培养基配方。方法在单因素试验的基础上通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验以及Box-benhnken响应面法设计优化A-40926 B_(0)发酵培养基,使用Design Expert 13.0对实验数据进行分析。结果培养基各成分中影响A-40926 B_(0)产量的4个主要因素是麦芽糊精、黄豆饼粉、酵母浸粉和鱼蛋白胨,其最佳浓度分别为38.18、46.00、21.29和6.06 g/L,A-40926 B_(0)产量达到2379.67 mg/L。结论经优化后,A-40926 B_(0)的摇瓶产量较原始培养基产量提高了281.39%,为后期发酵罐中试与生产提供了重要参考。

4-羟基环孢素高产菌株诱变筛选及培养基优化

以4-羟基环孢素转化菌Nonomuraea dietziae为出发菌,采用紫外-氯化锂复合诱变的方法,筛选得到一株产量达208 mg/L的稳定遗传菌J263,较出发菌164 mg/L的产量提高26.8%。在此基础上,采取单因素法和响应面法针对诱变菌的发酵培养基碳氮源进行系统优化,并对金属离子的添加进行考察。最终获得最佳的培养基配方(甘油26.5 g/L,糊精11.6 g/L,蛋白胨9.7 g/L,酵母浸粉3.5 g/L,大豆饼粉15.0 g/L,大豆油2.0 g/L,硫酸镁0.40 g/L,硫酸锰0.010 g/L,钼酸铵0.010 g/L)。在最优化条件下,4-羟基环孢素产量可达324 mg/L,较出发菌提高97.6%。

4-羟基环孢菌素A衍生物[γHyMeLeu4]CyA生产菌的接合转移

将染色体整合型糖多孢红霉菌表达载体pZMW-tsr转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002);以其作为供体,采用接合转移的方法将硫链丝菌素抗性基因tsr转入4-羟基环孢菌素A衍生物[γHyMeLeu4]CyA生产菌野野村菌CYA4OH。PCR结果表明,tsr基因已经整合到CYA4OH基因组上。研究表明pZMW载体能够在稀有放线菌野野村菌中有效表达外源基因。

野野村氏菌FIM02-765的分类鉴定及Simaomicinα的抗肿瘤活性

明确海洋沉积物来源的放线菌FIM02-765的分类地位,揭示其代谢产物Simaomicinα的抗肿瘤活性。通过形态学、生理生化特征、细胞糖分组成分析以及16S rRNA序列分析,对海洋放线菌FIM02-765进行菌种鉴定;通过大孔吸附树脂柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析从该菌的发酵产物中分离得到稠环氧杂蒽酮类化合物Simaomicinα;通过MTT法对化合物Simaomicinα的体外抗肿瘤细胞活性进行了研究。结果表明,菌株FIM02-765属于野野村氏菌(Nonomuraea sp.),同时该菌产生的稠环氧杂蒽酮类化合物Simaomicinα具有较强体外抑制多种肿瘤细胞增殖的活性。研究表明1株经鉴定的海洋野野村氏菌FIM02-765产生稠环氧杂蒽酮类化合物Simaomicinα对肿瘤细胞具有较强体外抑制活性,为深入开展该菌的遗传育种以及Simaomicinα的生物合成研究提供参考。

野野村放线菌ATCC 39727利用短链羧酸合成细胞脂肪酸

本实验对野野村放线菌ATCC 39727利用外源添加的不同短链羧酸为起始物合成细胞脂肪酸的能力进行了研究,结果表明,该菌优先利用异丁酰CoA、丁酰CoA和丙酰CoA为细胞脂肪酸合成起始物,但利用3-甲基丁酰CoA为脂肪酸合成起始物的能力较差。细胞脂肪酸中检出了以2-甲基丁酰CoA为起始物合成的anteiso-C17:0脂肪酸,但外源添加2-甲基丁酸却导致anteiso-C17:0脂肪酸质量分数降低。根据研究结果推测,野野村放线菌ATCC 39727细胞脂肪酸的合成取决于合成起始物的量及对脂肪酸合成酶的亲和性。

野野村放线菌ATCC 39727的双组份信号转导系统的生物信息学分析

双组份信号转导系统是放线菌中重要的全局调控系统之一,参与细胞形态分化、氮磷代谢、次级代谢产物合成和其他生理代谢过程。本文采用生物信息学方法系统分析了Nonomuraea sp.中双组份信号转导系统(two-component signal transduction system,TCS)的分布、系统分类、结构与功能,初步构建了部分TCS调控网络,旨在揭示Nonomuraea sp.中次级代谢产物合成与TCS之间的关系,为提高糖肽抗生素A40926效价和发现新的潜在生物活性物质奠定基础。

CTAB法提取野野村菌基因组DNA

针对用常规方法难以提取野野村菌基因组DNA的问题,通过选用添加甘氨酸的不同培养基和不同培养时间获得的菌丝体,采用液氮研磨结合CTAB法提取野野村菌DNA,电泳检测及计算OD260/OD280值。结果表明,在添加0.3%甘氨酸的麦芽汁-酵母膏(YE)培养基中振荡培养培养3d的菌丝体适合于DNA提取,用CTAB法获得的基因组DNA,长度约为20kb,且OD260/OD280在1.8左右,达到基因组DNA-DNA杂交的要求。

糖肽类抗生素A40926B产生菌的培养基优化及菌种选育

以A40926 B产生菌野野村放线菌SIPI-D-30为出发菌株,通过UV诱变及乙酸钠和甘氨酸抗性平板筛选,获得A40926 B产量提高的突变株SIPI-U-157。经优化,确定摇瓶发酵培养基(g/L)为:葡萄糖5.0、麦芽糊精30.0、可溶性淀粉10.0、玉米淀粉30.0、大豆蛋白胨5.0、肉蛋白胨10.0、酵母浸粉5.0、冷榨黄豆饼粉10.0、棉籽饼粉5.0、L-缬氨酸1.0,发酵培养7 d,突变株的A40926 B发酵单位为893 mg/L。该突变株在5 L发酵罐中培养180 h,A40926 B的产量最高为583 mg/L。