An Efficient Synthetic Method of Nordihydroguaiaretic Acid (NDGA)

Nordihydroguaiaretic acid (NDGA) has been synthesized in nine steps from piperonal using Stobbe condensation as the key step with high yield. By this approach, five relative natural products were obtained.

Study of apoptosis induced by nordihydroguaiaretic acid in human malignant glioma cell line SHG-44

Objective:To investigate the effect and mechanism of nordihydroguaiaretic acid (NDGA) on apoptosis in human malignant glioma cell line SHG-44. Methods: Cell growth inhibition was measured with MTT assay. Cell apoptosis was observed with light and electron microscopy and TUNEL. Expression of bcl-2 gene was measured with immunohistochemistry, in situ hybridization and image analyses. Results: NDGA at the concentration of 100 μmol/L inhibited the proliferation of SHG-44 cells and induced apoptosis in a time-dependent manner. The expression of Bcl-2 protein in SHG-44 cells was decreased in the present of 100 μmol/L NDGA along with the duration of treatment in a negative correlation with the degree of cell apoptosis. The bcl-2 mRNA expressed in SHG-44 cells was reduced after treatment with 100 μmol/L NDGA, apparently consistent with the immunohistochemical results. Conclusion: NDGA can induce apoptosis of human malignant glioma cells probably by down-regulating expression of bcl-2 gene, though the exact mechanism needs further study.

SHG－44细胞显微注射NDGA诱导分化的初步观察

采用显微注射系统对ＳＨＧ－４４细胞进行单细胞微量注射技术的探讨，并观察去甲二氢愈创木酸（ＮＤＧＡ）注射后的作用。结果显示，体积较小的肿瘤细胞显微注射成功的关键在于注射参数的正确设定、细胞标记、注射针下限值的确定、注射过程中防污染以及操作细致、迅速；ＮＤＧＡ注射ＳＨＧ－４４细胞后的诱导分化作用较其在细胞外培养基中的作用更直接、迅速和显著，亦更持久。

NDGA诱导人胶质瘤细胞株分化过程中基因组甲基化及甲基转移酶的变化及意义

目的 了解去甲二氢愈创木酸 (Nordihydroguaiareticacid ,NDGA)处理前后两种人胶质瘤细胞系CHG 5、SHG 4 4甲基转移酶 (DNAmethyltransferase ,DNMT)活性、DNMTmRNA表达和基因组甲基化程度的改变。方法 以NDGA处理人恶性胶质瘤细胞系CHG 5及SHG 4 4,观察两种细胞增殖和分化状态 ;采用同位素微量示踪法测定甲基转移酶活性和基因组DNA甲基化程度 ;应用RT PCR法测定DNMTmRNA表达水平。结果 NDGA处理后两种细胞增殖速度明显减缓 ,分化水平升高 ;DNMT活性显著降低、基因组甲基化程度明显升高 ;而DNMTmRNA改变不明显。结论 NDGA能抑制甲基转移酶的活性 ,升高基因组甲基化水平 ,这些作用可能与其诱导恶性胶质细胞瘤分化的机制有关。

NDGA对脑缺血/再灌注损伤的脑保护作用

目的探讨12/15-LOX抑制剂去甲二氢化愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid,NDGA)是否具有对抗缺血/再灌注损伤的脑保护作用。方法体内实验部分:线栓法(MCAO)制备大鼠脑缺血/再灌注损伤模型,随机分为NDGA处理组、溶剂对照组(DMSO)及假手术组。首先对各组大鼠进行神经功能评分,并进行组间比较;其次采用TTC法比较各组动物脑梗死体积的差异。体外实验部分:制备大鼠皮层神经元糖氧剥夺(OGD)细胞模型,随机分为OGD+NDGA组、OGD+溶剂对照组及空白对照组。分别采MTT法和TUNEL法检测各组神经元的细胞活力和凋亡情况,并进行组间比较。结果体内实验结果显示NDGA处理组与溶剂对照组相比,神经功能缺损显著改善(P<0.05),梗死体积百分比显著减小(P<0.05)。体外实验结果显示NDGA可显著提高OGD再合氧后的神经元存活率(P<0.05),同时NDGA处理组TUNEL阳性细胞比率亦明显降低(P<0.05)。结论 12/15-LOX抑制剂NDGA能够改善缺血/再灌注损伤大鼠的神经功能缺损,减少梗死体积,提高缺血/再灌注损伤后神经元的存活率,抑制神经元细胞凋亡,因此具有对抗缺血/再灌注损伤的脑保护作用。

去甲二氢愈创木酸对恶性胶质瘤细胞增殖和分化的影响

目的：观察去甲二氢愈创木酸（ＮＤＧＡ）对人恶性胶质瘤细胞系ＳＨＧ－４４细胞增殖和分化的影响。方法：细胞培养、免疫组化、光镜和电镜观察及流式细胞仪检测。结果：①在２００μｍｏｌ／Ｌ浓度范围内，ＮＤＧＡ对ＳＨＧ－４４细胞有增殖抑制和诱导分化作用，且这种作用与浓度呈正相关；②在ＮＤＧＡ处理９６ｈ内，ＮＤＧＡ对ＳＨＧ－４４细胞的增殖抑制作用以处理后２４ｈ最明显；③ＮＤＧＡ处理后，ＳＨＧ－４４细胞增殖受阻于Ｇ１→Ｓ期。结论：ＮＤＧＡ对ＳＨＧ－４４细胞有明显的增殖抑制和诱导分化作用，且这种作用有周期特异性。

去甲二氢愈创木酸对恶性胶质瘤细胞周期的影响

目的 观察去甲二氢愈创木酸 (NDGA)对人恶性胶质瘤细胞系SHG 4 4细胞周期的影响。方法 采用细胞培养、免疫组化、细胞计数及流式细胞仪检测等技术方法。结果 ①在 2 0 0 μM浓度范围内 ,NDGA对SHG 4 4细胞增殖有抑制作用 ,使细胞增殖受阻于G1→S期 ,且这种作用与浓度呈正相关 ;②在NDGA处理 96小时内 ,NDGA对SHG 4 4细胞的增殖抑制作用以处理后 2 4小时最明显 ;③NDGA处理后 ,SHG 4 4细胞cyclinD1和CDK4 蛋白表达减弱 ,p16蛋白表达增强。结论 NDGA对SHG 4 4细胞周期有明显的增殖抑制作用 ,且这种作用可能与CDK4 蛋白激酶活性降低有关。

去甲二氢愈创木酸诱导体外恶性胶质瘤细胞凋亡的研究

目的:观察去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiareticacid,NDGA)对人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞凋亡的影响,并探讨其发生的可能机理。方法:采用MTT(methythiazolyltetrazolium)法检测细胞增殖抑制的情况,利用光镜和电镜观察及TUNEL法检测体外培养细胞的凋亡情况,用免疫组织化学、原位杂交和图像分析等方法检测bcl-2基因mRNA和蛋白的表达水平。结果:①一定浓度(100μmol/L)的NDGA处理SHG-44细胞不同时间后,在NDGA抑制细胞增殖的同时,也可诱导此细胞发生凋亡,且随着作用时间的延长,凋亡细胞数增加越明显;②免疫组化染色结果表明,一定浓度的NDGA处理细胞不同时间后,出现SHG-44细胞bcl-2蛋白表达水平降低,且随着作用时间的延长,这种趋势更加明显,与细胞凋亡的发生呈负相关;③原位杂交结果显示,NDGA处理细胞不同时间后,出现SHG-44细胞bcl-2基因mRNA的表达水平降低,结果与免疫组化检测一致。结论:NDGA可诱导SHG-44细胞的凋亡,这种作用可能与其下调bcl-2基因的表达有关,确切机制有待进一步深入研究。

去甲二氢愈创木酸对活体血管生成作用的实验研究

目的 观察去甲二氢愈创木酸 (NDGA)对在体血管生成的影响。方法 采用鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)试验 ,检测NDGA对血管生成的影响。结果 2 .5× 1 0 -6mmol以上量的NDGA均对血管生成有抑制作用 ,在实验剂量 ( 0 .5～ 5 0 )× 1 0 -6mmol范围内 ,随给药量的增加 ,其抑制作用愈加明显。采用Bouin’s液原位固定后取膜、DAB染色、普通显微镜下观察或用图像分析方法可使结果更具可信性与可比性。结论 NDGA可抑制血管生成 。

去甲二氢愈创木酸对胶质瘤诱导的血管内皮细胞成型的作用

目的 观察去甲二氢愈创木酸 (NDGA)对胶质瘤细胞诱导的内皮细胞成型的影响并初步探讨其机理。 方法 采用在 型胶原凝胶上的细胞立体培养和内皮 -胶质瘤细胞的联合培养法 ,观测人恶性胶质瘤细胞系SHG- 44细胞或其条件培养基对人脐静脉内皮细胞系 ECV- 30 4细胞形成管腔样结构的影响 ,同时以免疫组织化学结合图像分析的方法检测 SHG- 44细胞 VEGF、b FGF蛋白的表达。 结果 10 0 μmol/ L 的 NDGA作用 1～ 3d后 ,SHG- 44细胞 VEGF、b FGF的表达明显降低。联合培养 3d左右 ,胶质瘤 SHG- 44细胞及其条件培养基均能诱导内皮细胞在 型胶原凝胶上拉长并形成管腔样结构 ;而 10 0 μm ol/ L 的 NDGA可明显抑制内皮细胞变长和管腔样结构的形成 (P<0 .0 1)。 结论 NDGA对胶质瘤细胞诱导的血管成型有抑制作用 ,此作用可能与瘤细胞 VEGF、b FGF表达减低有关 ,提示

去甲二氢愈创木酸对人恶性胶质瘤细胞系CHG-5生长的影响

目的 观察去甲二氢愈创木酸 (nordihydroguaiareticacid ,NDGA)对人恶性胶质瘤细胞系CHG 5体内外生长的影响。方法 采用MTT法、流式细胞仪、光镜等技术观察CHG 5细胞体外增殖、细胞周期、凋亡和裸鼠移植瘤生长情况。结果 NDGA可显著抑制CHG 5细胞体外增殖 ,G0 G1 期细胞明显增多 ,S、G2 M期细胞减少 ,凋亡细胞增加。采用接种后第 5天按 5 0mg kg腹腔内注射给药 ,治疗组移植瘤体积较对照组缩小 ,未见明显的毒副作用。结论 NDGA对CHG 5细胞的体内外生长具有一定的抑制作用 。

去甲二氢愈创木酸对VEGF及其受体KDR基因表达影响的研究

目的 探讨去甲二氢愈创木酸 (NDGA)对血管生成因子 (VEGF)及其相应受体KDR基因表达状况的影响及其意义。方法 采用免疫组化、原位杂交及图像分析等技术方法观测NDGA作用下人恶性胶质瘤细胞系SHG 44细胞VEGF基因、人脐静脉内皮细胞系ECV 30 4细胞VEGF的相应受体KDR基因表达的变化。结果 ① 1 0 0 μmol/L的NDGA处理胶质瘤细胞 1～ 3d ,引起VEGF蛋白及mRNA表达水平的降低 ;② 1 0 0 μmol/L的NDGA处理内皮细胞 1～ 3d ,受体KDR的蛋白表达也呈下降趋势 ,且KDR基因表达的降低较胶质瘤细胞VEGF的降低更为明显。结论 NDGA对胶质瘤细胞VEGF的表达有抑制作用 ,NDGA也抑制了内皮细胞KDR的表达 。

高效液相色谱法测定去甲二氢愈创木酸的含量及其有关物质

目的建立测定去甲二氢愈创木酸(NDGA)含量和检查有关物质的HPLC方法。方法采用ZorbaxSB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),检测波长为282nm。含量测定以三氟醋酸-水-乙腈(0.05:45:55,pH3.5)为流动相,有关物质检查采用梯度洗脱,以三氟醋酸-水(0.05:100)为流动相A,三氟醋酸-乙腈(0.05:100)为流动相B,洗脱梯度:0～15min,流动相B的比例为40%～70%,15～30min,流动相B的比例为70%。结果NDGA浓度为5.0～100.0μg/ml时,峰面积与其浓度呈良好的线性关系(r=0.9999),检测限为1.2ng(S/n=3),含量测定重复性试验RSD为0.54%(n=6)。有关物质检查重复性试验RSD1.8%(n=6)。结论本法简便、准确、快速、灵敏,可用于NDGA的质量控制。

bcl-2、c-myc基因表达在去甲二氢愈创木酸诱导人恶性胶质瘤细胞凋亡中的意义

目的 观察bcl 2、c myc在去甲二氢愈创木酸 (NDGA)诱导恶性胶质瘤细胞系SHG 44细胞凋亡中的变化及意义。方法 利用光镜和电镜观察及TUNEL法检测培养细胞凋亡的情况 ,用免疫组织化学、原位杂交和图像分析等方法检测bcl 2、c myc基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 ①一定浓度的NDGA处理SHG 44细胞 1 2～ 96h ,均可诱导SHG 44细胞发生凋亡 ,且随着作用时间的延长 ,凋亡细胞数增加越明显 ;②经NDGA处理细胞后 ,出现SHG 44细胞bcl 2、c myc蛋白表达水平降低 ,且随着作用时间的延长 ,这种趋势更加明显 ,与细胞凋亡的发生密切相关 ;③原位杂交结果显示 ,NDGA处理细胞不同时间后 ,出现SHG 44细胞bcl 2、c myc基因mRNA的表达水平降低 ,结果与免疫组化检测一致。结论 NDGA诱导SHG 44细胞的凋亡可能与其下调bcl 2、c myc基因的表达有关 。

食品中正二氢愈疮酸含量的高效液相色谱荧光法测定

建立了高效液相色谱荧光法(HPLC-FLD)测定食品中正二氢愈疮酸含量的方法。采用Luna C18(4.6×150 nm,3.0μm)的色谱柱,以0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL/min;激发波长为280nm,发射波长为306nm。在优化的前处理和色谱条件下,正二氢愈疮酸能够与样品基质完全分离,且加标回收率范围为92.43%～99.23%。

去甲二氢愈创木酸的全合成

以香草醛为原料，经甲醚化，氧化和Ｃｌａｉｓｅｎ缩合，合成了相应的β酮酸酯，再经改进的Ｋｎｏｒ反应，实现β酮酸酯的偶联，通过环化、选择性氢化还原等反应，成功地合成了去甲二氢愈创木酸（ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃａｃｉｄ）；呋喃愈创木酚二甲醚（ｆｕｒｏｇｕａｉａｃｉｎｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）和二氢愈创木酸二甲醚（ｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃａｃｉｄｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）。

去甲二氢愈创木酸对内皮细胞影响的形态学观察

目的 探讨去甲二氢愈创木酸 (NDGA)对内皮细胞形态的影响及特点。方法 采用倒置显微镜、光镜、电镜和流式细胞仪观察分析不同浓度NDGA作用下人脐静脉内皮细胞系ECV 30 4细胞形态和细胞凋亡峰的变化。结果 ①不同浓度 ( 5 0～ 2 0 0μmol/L)的NDGA处理ECV 30 4细胞 2 4～ 72h后或一定浓度 ( 1 0 0 μmol/L)的NDGA处理ECV 30 4细胞不同时间 ( 1～ 7d)后 ,内皮细胞由多角形变长 ,呈梭形 ,细胞稀疏 ,核分裂像明显减少 ,显示细胞增殖的抑制 ,上述变化与NDGA的浓度和作用时间有关 ;②NDGA处理后 ,部分细胞呈现出凋亡样形态学改变 ,以 48h为明显。流式细胞仪检测也出现明显高于对照的凋亡峰即亚G0 峰 ,1 2h时相点最高 ( 2 0 .42 % )。此外 ,处理后的细胞也有变性、坏死等病理变化 ,与NDGA的浓度呈正比。结论 NDGA对内皮细胞的生长和增殖有抑制 ,形态学初步证明也有诱导凋亡等作用 。

去甲二氢愈创木酸对恶性胶质瘤细胞基因组甲基化水平的影响及其意义

目的 探讨去甲二氢愈创木酸 (NDGA)诱导人恶性胶质瘤细胞系SHG 44细胞分化过程中基因组甲基化状态改变及其意义。方法 合成甲基化敏感性AP PCR引物 ,用AP PCR方法检测SHG 44细胞基因组甲基化状态 ,观察NDGA诱导该细胞分化过程中甲基化水平的变化。结果 对照组基因组DNA经MspⅠ酶解后AP PCR扩增片段比HpaⅡ酶解后的扩增片段小 ,几乎未见存留大片段 ,至少有 3个片段与HpaⅡ酶解片段不同。同一时相点HpaⅡ酶解后扩增产物相比 ,NDGA处理后基因组DNAMspⅠ酶解后的扩增产物量较少、条带较多 ,且随时相点延长产物量逐渐增加 ,条带增多。结论 NDGA诱导人恶性胶质瘤细胞系SHG 44细胞分化过程中基因组甲基化状态增高 。

5-氟尿嘧啶、长春新碱与去甲二氢愈创木酸配伍对人恶性胶质瘤细胞株的作用

目的 观察体外应用去甲二氢愈创木酸（ＮＤＧＡ）、予氟尿嘧啶（５－Ｆｕ）、长春新碱（ＶＣＲ）三种药物单用或合用对人恶性胶质瘤细胞系 ＳＨＧ－４４细胞的作用，并探讨其作用的可能机制。方法用 ＭＴＴ法检测药物作用效应，用免疫组化染色法检测细胞 ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１基因的蛋白表达情况。结果 （１）三种药物单用及两药合用时随着药物浓度的增加其抗肿瘤效应也增加，且两药合用时药物的效应增强；（２）先给ＮＤＧＡ ２４ｈ后再给 ５－Ｆｕ或 ＶＣＲ，与同时给药对该细胞的抗肿瘤效应无显著差异（Ｐ＞０．０５），而先给 ５－Ｆｕ或 ＶＣＲ ２４ｈ后再给 ＮＤＧＡ，与同时给药对细胞的抗肿瘤效应有显著差异（Ｐ＜０．０５）；（３）免疫组化染色结果表明，与对照组相比，ＮＤＧＡ处理后该细胞 ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１基因的蛋白表达明显降低。结论 ＮＤＧＡ与 ５Ｆｕ或 ＶＣＲ间有协同作用，且这种作用可能与 ＮＤＧＡ降低细胞 ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１基因的蛋白表达有关。

诺帝对HPV 16亚基因永生化人宫颈上皮细胞增殖、凋亡和分化的影响

目的：研究诺帝（Nordy）对HPV 16型亚基因（E6、E7）永生化人宫颈上皮细胞（H8细胞）增殖、分化和凋亡的影响。方法：MTT法检测诺帝对H8细胞增殖的抑制作用，SP法检测增殖细胞核抗原mcm 5的表达，FCM分析细胞周期和凋亡，光学显微镜、电子显微镜观察细胞形态变化，端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附法（telomerase repeat amplification protocol-enzyme linked immunosorbent assay，TRAP—ELISA）法检测端粒酶活性变化。结果：10～100μmol/L浓度的诺帝能够不同程度地抑制H8细胞的增殖，细胞核内mcm 5的表达明显下降，可阻滞细胞周期于G0／G1期、S期细胞减少，细胞凋亡率增多，细胞形态上出现向成熟分化的趋势，端粒酶活性明显降低。结论：诺帝具有抑制H8细胞增殖，促进凋亡，诱导其分化的作用，这种作用可能是通过阻滞细胞周期，降低端粒酶活性来实现的。