利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行内参基因稳定性分析的方法

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点,已经成为研究基因表达分析的常用方法,但其结果的准确性取决于内参基因。在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在,科研工作者为了获得精准的试验结果,首先必须从众多的内参基因中筛选出稳定的内参基因。geNorm、NormFinder和BestKeeper等是专门用于筛选稳定性内参基因的软件,但这3种软件使用方法差异很大,为了让更多的科研人员了解这些软件、节省时间,笔者结合自己的科研经验详细介绍了这3种软件的使用方法,以期为相关科研人员利用这些软件筛选内参基因提供便利。

桂花组织基因表达中荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选桂花Osmanthus fragrans不同组织基因表达分析中适合的内参基因,以桂花‘堰虹桂’O.fragrans‘YanhongGui’花蕾、盛开花序、嫩叶、成熟叶和1年生茎等5个不同组织为材料,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测7个候选内参基因的表达水平,并利用geNorm,NormFinder和BestKeeper软件对各候选内参基因的表达稳定性进行评价,最后利用桂花不同组织中OfCRTISO1基因相对表达水平验证筛选的内参基因的可靠性。结果表明:综合3个软件的评价排序,确定不同组织中最佳内参基因为OfRAN1和OfUBC2,而Of18S是最差内参基因。OfCRTISO1基因相对表达水平分析证实,不同组织中qRT-PCR分析使用OfRAN1和OfUBC2等2个表达最稳定的基因组合,即可获得更为精确的基因表达结果。旨在为桂花组织间重要基因的定量表达分析提供科学依据。

产蛋前期和产蛋期籽鹅组织内参基因的稳定性

【目的】分析比较使用广泛的7个候选内参基因在产蛋前期和产蛋期籽鹅组织中的表达情况,筛选籽鹅组织基因表达分析中最佳的内参基因及其数目。【方法】应用实时定量反转录PCR技术,分别检测28S rRNA、18S rRNA、GAPDH、ACTB、HPRT1、SDH和TUB在产蛋前期与产蛋期健康籽鹅肝脏、肾脏、心脏、腿肌和卵巢组织中的表达情况,采用绝对定量方法确定基因拷贝数,然后分别使用geNorm和NormFinder程序进行数据分析。【结果】产蛋前期籽鹅各组织中7个内参基因表达稳定度的顺序分别为:GAPDH=HRPT1(0.195)>TUB(0.244)>28SrRNA(0.414)>18S rRNA(0.495)>ACTB(0.541)>SDH(0.610);产蛋期籽鹅各组织中7个内参基因表达稳定度的顺序分别为:GAPDH=28S rRNA(0.128)>TUB(0.181)>ACTB(0.192)>SDH(0.221)>HRPT1(0.316)>18S rRNA(0.362),且7个基因的配对差异分析分别为V2/3(产蛋前期)=0.084、V2/3(产蛋期)=0.069,内参基因的最适数目均为2个。【结论】产蛋前期和产蛋期籽鹅组织目的基因的表达分析中相对适合的内参基因分别为GAPDH和HRPT1、GAPDH和28S rRNA。

鹿茸组织中内参基因的筛选和验证

为筛选在不同生长时期鹿茸组织中稳定表达的内参基因,试验以不同生长时期(分别为脱盘后10、20、40和60d)的鹿茸组织为材料,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β2-微球蛋白(B2M)、还原型辅酶Ⅰ(NADH)、60S核糖体蛋白L40(RPL40)、谷胱甘肽还原酶7(GPx)和β肌动蛋白(ACTB)6个看家基因的表达情况,并运用geNorm和NormFinder两个程序综合分析6个看家基因的表达稳定性。结果显示,GAPDH、ACTB、RPL40表达稳定性较好,可用作鹿茸基因表达研究的内参基因,而NADH和GPx的稳定性最差,不适合作内参基因。通过对鹿茸生长相关基因(ANXA5、HSP27、PRD2、CRABP1、LGALS1)表达分析,进一步验证了上述结果,并且发现这5种基因均在脱盘后10d的鹿茸组织中高表达。该研究结果为鹿茸快速生长及骨化相关基因的研究奠定了一定基础。

实时荧光定量PCR研究蛋鸡组织基因表达的内参基因筛选

为筛选出蛋鸡不同组织中稳定表达的内参基因,试验以120日龄的海兰灰蛋鸡(Gallus domesticus)为试验动物,选取常见内参基因RPS2、β-actin、GAPDH和HMBS作为候选基因,利用实时荧光定量PCR技术Ct值分析法对4个候选内参基因的相对表达进行测定,利用独立评价软件geNorm和NormFinder对蛋鸡的4个候选内参基因在不同组织(心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肠、胫骨、胰脏和子宫)中的表达稳定性进行评价。结果显示,Ct值分析和geNorm程序分析均得出相似的结果,即RPS2基因始终占主导地位,稳定性最强,β-actin基因次之;NormFinder软件分析显示,HMBS基因稳定性最好,最佳组合为HMBS和RPS2基因;当分析不同组织中表达恒定的内参基因时,发现不同组织最稳定的内参基因也不完全相同。由此说明,不同的组织器官和不同的分析方法得出的结论虽然不完全一致,但它们却有着一定的潜在共性,发展趋势有一定相似性,即RPS2和β-actin基因相对稳定性更强。

孟氏隐唇瓢虫qRT-PCR分析中内参基因的筛选

选择合适的内参基因是qRT-PCR研究的关键。本文以孟氏隐唇瓢虫Cryptolaemus montrouzieri Mulsant为研究材料,利用qRT-PCR技术,对孟氏隐唇瓢虫4个候选内参基因Actin、RPS23、GAPDH和β-tubulin的mRNA的表达量进行了分析,并用Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件分析它们在孟氏隐唇瓢虫不同发育阶段及成虫不同组织中的表达稳定性。结果表明,以成虫不同组织为材料时,综合三种软件分析结果显示4个候选基因表达稳定性平均等级值排名为RPS23(rank=1)>β-tubulin(rank=2.3)>GAPDH(rank=3)>Actin(rank=3.7),以不同发育时期虫体为材料时,综合分析结果显示4个候选内参基因表达稳定性平均等级值排名为RPS23(rank=1.7)>Actin(rank=2)>GAPDH(rank=2.7)>β-tubulin(rank=3.7)。综合分析在瓢虫不同发育阶段及成虫不同组织两种处理下,三种软件的评价效果,4个候选基因表达稳定性等级值的总平均排名为RPS23(rank=1.3)>Actin(rank=2.8)=GAPDH(rank=2.8)>β-tubulin(rank=3)。RPS23在瓢虫不同发育阶段及成虫不同组织中均显示出较高的表达稳定性及与其它基因之间极大的相关性,可以确定为孟氏隐唇虫不同发育阶段及成虫不同组织基因表达分析中一个稳定表达的基因,可作为单个内参基因或者其它内参基因的协同基因,本实验为开展孟氏隐唇瓢虫功能基因表达分析奠定了方法学基础。

大蒲莲猪不同发育阶段组织RT-qPCR分析中适宜内参基因筛选

利用适宜数量且表达稳定的内参基因对目的基因的表达量进行标准化是获得准确、可靠RT-qPCR数据的重要条件。以不同日龄大蒲莲猪8种组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠组织、肌肉、血液)为试验材料,使用ge Norm、Norm Find软件对8个常用候选内参基因(ACTB、B2M、GAPDH、RPL4、SDHA、TBP、YWHAZ、PPIA)的表达稳定性进行分析,筛选适宜内参基因及其组合。ge Norm、Norm Find软件联合分析结果表明,不同日龄大蒲莲猪心脏中表达最稳定的内参基因为TBP、PPIA和YWHAZ,肝脏、肾脏、肠组织和肌肉中最稳定的内参基因均为TBP和PPIA,脾脏中表达最稳定内参基因为TBP和RPL4,肺脏中表达最稳定内参基因为TBP、RPL4、PPIA和ACTB,血液中表达最稳定内参基因为ACTB、YWHAZ和GAPDH。由于大蒲莲猪8种体组织中最适宜内参基因组合和数量不同,因此内参基因筛选是进行RT-qPCR数据分析的必要条件。结果可为研究大蒲莲猪目的基因表达时适宜内参基因的选择提供帮助。

实时定量RT-PCR检测肝癌miRNA表达中内参的选择

目的探讨肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织采用实时定量RT-PCR(RT-qPCR)技术检测miRNA表达最佳内参的选择。方法采用实时RT-qPCR技术检测7个内参RNU6B、RNU48、RNU66、RNU44、RNU43、5s rRNA和18s rRNA在70例HCC及相应癌旁肝组织中的表达。并使用NormFinder及geNorm软件分析最优化的内参。结果 7个内参表达结果存在差异。NormFinder及geNorm软件均显示RNU6B+RNU48组合为肝组织的最佳内参。结论使用实时定量RT-qPCR研究目标miRNA相对定量表达时,为保证数据的精确性和客观性,在实验前对内参进行慎重的筛选是必不可少的。NormFinder及geNorm软件可用于各种实验因素下适宜内参的选择。

肝癌实时定量RT-PCR中适宜内参基因的选择

目的探讨肝癌（HCC）组织及细胞系实时定量RT-PCR最佳的内参基因选择。方法通过实时定量RT-PCR,检测HMBS、CTBP1、HPRT1、UBC、B2M、SDHA、RPLI3A、EIF4A1、TUBB、YWHAZ、ACTB、GUSB、GAPDH、18 s rRNA和28 s rRNA 15个内参基因在70例HCC、癌旁肝组织及阿法替尼作用后4个HCC细胞系的表达情况。并使用NormFinder及geNorm软件分析最优化的内参基因。结果 15个内参基因表达存在差异,Cq值在8~29.2间。GAPDH在HCC及癌旁肝组织表达差异有显著性（P〈0.05）。结论NormFinder及geNorm软件均显示HMBS＋UBC组合为肝组织的最佳内参,HMBS＋RPLI3A组合为体外肝癌细胞系的最适宜内参。

小鼠哮喘模型颈静脉-结状神经节内参基因的筛选

目的观察12个常用看家基因在正常小鼠和哮喘小鼠颈静脉-结状神经节的表达变化,选择合适的内参基因为进一步基因表达分析研究得到可信数据提供依据。方法雌性BALB/c小鼠随机分为哮喘模型组和对照组,制备哮喘模型,用实时荧光定量PCR技术,经geNorm及Normfinder程序分析,评价了12个常用看家基因CYC1、UBC、RPL13、YWHAZ、18srRNA、B2M、SDHA、ATP5B、CANX、ACTB、EIF4A2和GAPDH在小鼠颈-结状神经节的表达稳定性。结果 12个候选看家基因在小鼠神经节的表达差异较大,其中GAPDH、18srRNA、CANX、ACTB和EIF4A2表达相对稳定,而CYC1、UBC和RPL13的表达在两组小鼠神经节变化幅度较大,结合两种分析证实GAPDH是其中最稳定的内参基因。结论本研究结果提示GAPDH是研究哮喘小鼠和正常小鼠颈静脉-结状神经节基因表达的最佳内参基因,同时也为进一步认识在不同实验模型确定适宜内参基因的重要性提供依据。

刺槐实时定量PCR分析中内参基因的选择

实时荧光定量PCR 是由美国Applied Biosystems 公司于1996年在传统的PCR 技术基础上发展起来的一种新的核酸定量技术（ Mackay，2004），具有定量准确、灵敏度高、特异性强、重复性好及高通量等优点（Huggett et al．，2005），已成为医学、农学、林学、微生物学等众多领域中进行基因表达和转录组分析的常用技术之一（ Postollec et al．，2011；袁亚男等，2008）。

短小芽孢杆菌实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

为了利用荧光定量PCR方法分析短小芽孢杆菌的基因表达水平,需要首先确定适合该菌株的荧光定量PCR分析内参基因。以短小芽孢杆菌的16S rRNA、mecA、cadR、rpoB及sphP共5个基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR的方法分析这5个候选基因在短小芽孢杆菌发酵培养不同时间点的表达情况,再用geNorm和NormFinder软件评估它们的表达稳定性。结果显示,利用geNorm软件分析得出16S rRNA和mecA是表达最稳定的基因,最适内参基因数为2。NormFindr软件分析得出mecA为最稳定的基因。对短小芽孢杆菌3个功能基因的差异表达分析结果表明,16S rRNA和mecA都是合适的内参基因,而mecA基因由于表达丰度适中,更适合于作为内参基因研究结构基因的表达。为了得到更准确的差异表达结果,也可用两个基因同时进行校正。

牛转FAD3B基因胎儿成纤维细胞中内参基因的稳定性评估

采用RT-PCR扩增亚麻种子(Linum usitatissimumLinn)FAD3B基因,构建不同启动子的两种重组真核表达载体pIRES-AcGFP-CMV-FAD3B和pIRES-AcGFP-CAG-FAD3B,通过qRT-PCR检测转基因细胞中FAD3B基因的表达水平。以不同过表达水平的转基因细胞为试验对象,评价9种候选内参基因ACTB、GAPDH、18S rRNA、UXT、PPP1R11、RPS15A、SF3A1、EEF1A2和HMBS的稳定性。根据GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种统计学算法得到的稳定性值对基因进行排序。结果显示,内参基因稳定性的综合排序为PPP1R11>EEF1A2>18S rRNA>RPS15A>GAPDH>HMBS>UXT>ACTB>SF3A1,其中PPP1R11和EEF1A2是最稳定的内参基因。稳定内参的选择可以更加准确地校正基因的表达水平,从而为阐述基因的功能奠定了坚实的基础。

金针菇实时荧光定量PCR内参基因的筛选

基于金针菇(Flammulina filiformis)基因组和转录组的测序组装结果,选取13个内参基因(α-TUB、β-TUB、PGM、RPL19C、RPL6、CYC、18S rRNA、Vha68、ACT、GPD、PAS、TEF和VSN),通过设计跨内含子引物,分别对金针菇不同菌株(Fy331、Fw12、川金10、Fv296、金黄11和福建白金)菌丝和Fy331菌株不同发育阶段(菌丝、原基、幼嫩子实体和成熟子实体)样品进行实时荧光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测,并采用ΔCt算法和NormFinder、BestKeeper、GeNorm等软件对检测结果进行表达稳定性分析,以期筛选出在不同菌株菌丝和不同发育阶段中稳定表达的内参基因。结果表明:Vha68、TEF和β-TUB基因在不同菌株菌丝中表达稳定;Vha68、ACT和GPD基因在不同发育阶段样品中表达稳定。综合评价与qRT-PCR验证分析结果显示,Vha68和TEF、Vha68和ACT分别适合作为金针菇不同菌株菌丝、不同发育阶段qRT-PCR检测基因表达的最佳内参基因。

朱红毛斑蛾实时荧光定量PCR内参基因的筛选

筛选朱红毛斑蛾Phauda flammans(Walker)在不同成虫组织、性别及发育阶段处理条件下稳定表达的内参基因,为进一步开展朱红毛斑蛾相关基因的定量研究提供参考。本研究以不同成虫组织(头、胸、腹、足、翅和触角)、不同成虫性别和不同发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)为实验材料,对10个候选内参基因进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR),并使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件及RefFinder网站对候选内参基因的表达稳定性进行评价和综合分析。结果表明:在朱红毛斑蛾不同成虫组织基因定量研究中,TUB2>GAPDH>TUB1>AK>EF1α>ACTIN3>TBP>TUB3>ACTIN2>RPL32,建议以TUB2和GAPDH作为内参基因;在不同成虫性别基因定量研究中,TUB1>EF1α>ACTIN3>RPL32>ACTIN2>TUB2>AK>GAPDH>TUB3>TBP,建议以TUB1和EF1α作为内参基因;在不同发育阶段基因定量研究中,ACTIN3>TBP>TUB1>EF1α>TUB3>ACTIN2>GAPDH>RPL32>TUB2>AK,建议以ACTIN3和TBP作为内参基因。基于GeNorm分析,最佳内参基因使用数目为2个。

UV-B胁迫下紫花苜蓿qRT-PCR内参基因的筛选

[目的]在植物代谢通路关键调控基因表达的相关研究中,筛选各种条件下合适的内参基因至关重要。[方法]以UV-B为主要胁迫,运用荧光定量PCR技术以及geNorm和NormFinder软件,对不同取样时间(处理后0、1、2和5d)的紫花苜蓿(MedicagosativaL.)幼苗根、茎、叶组织中Actin2、GAPDH、MSC27、18SRNA、β-tublin、bZIP、UBQ、PPPrep、Ms03_50f03和Ms03_69f07等候选内参基因表达的稳定性进行研究。[结果]geNorm软件显示:紫花苜蓿幼苗根部UV-B胁迫下MSC27和UBQ的稳定值(M)较小,增加第3个内参基因后变异值(V)基本不变,表明选用2个内参基因即可;茎部则是MSC27和Actin2的M值较小,同时相应的V值也满足要求;而使用M值较小的Actin2和GAPDH为内参,在研究叶片基因表达时可以获得更加准确的结果,当增加第3个内参基因时,V值变大,反而影响结果。同时发现,18SRNA和β-tublin在根和茎叶中的稳定性均较差,因此不适宜作为内参基因使用。NormFinder的结果与上述结果相似,结果差异部分的原因可能是因为算法不同。[结论]在UV-B胁迫下,紫花苜蓿幼苗根部中MSC27和UBQ的表达较为稳定,而在茎部则以MSC27和Actin2为宜,使用Actin2和GAPDH为内参在研究叶片基因表达时可以获得更加准确的结果。本研究对UV-B胁迫下紫花苜蓿中关键基因的定量表达分析具有重要的实用价值。

授粉后红球姜雌性生殖器官qRT-PCR的内参基因筛选

根据授粉后不同时间点的红球姜转录组数据库以及相关文献报道的传统内参基因,筛选出10个表达相对稳定的基因Actin-2(ACT2)、Actin-7(ACT7)、Beta tubulin-1(TUB1)、Beta tubulin-5(TUB5)、Alpha tubulin-3(TUA3)、Ubiquitin(UBQ)、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、Elongation factor 1-alpha(EF-1α)、Cyclophilin(CYP)、Histone(H2A)作为候选内参基因,采用qRT-PCR技术,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对候选内参基因的表达稳定性进行分析.结果表明,在红球姜雌性生殖器官授粉后的发育过程中,GAPDH和UBQ的表达稳定性最好,均适合作为内参基因,同时使用2种作为内参基因能使实时荧光定量PCR标准化分析结果更精确.因此,最终选择GAPDH和UBQ作为实时荧光定量PCR标准化分析红球姜雌性生殖器官相关基因表达的内参基因.该研究将为探究红球姜败育的分子机理奠定基础,也为近源姜属植物内参基因的筛选提供线索.

黄花大苞姜花药发育qRT-PCR内参基因筛选

qRT-PCR技术具有定量准确、灵敏度高、重复性好等特点,被广泛用于基因表达分析。内参基因的稳定性对于准确分析实验结果非常重要。该研究以黄花大苞姜(Caulokaempferia coenobialis)花粉母细胞时期(PMC)、四分体时期(TET)、成熟花粉时期(MP)的花药组织为材料,基于3个阶段花药转录组表达谱数据以及常用传统内参基因,筛选出Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、Malate dehydrogenase(MDH)、α-tubulin3(TUA3)、β-tubulin7(TUB7)和Actin6(ACT6)作为候选内参基因,进行qRT-PCR分析;并运用BestKeeper、geNorm和Normfinder软件综合分析5个候选内参基因在黄花大苞姜花药发育过程中的表达稳定性。结果表明:MDH和TUB7的表达最稳定,ACT6的稳定性最差;分别以MDH和TUB7作为内参,分析GBE1在黄花大苞姜花药发育中的表达模式,并与该基因在花药转录组中的表达模式做相关系数分析,3种表达模式结果一致,进一步验证了MDH和TUB7的表达稳定性。这说明MDH和TUB7适合作为qRTPCR分析黄花大苞姜花药发育过程中相关基因表达模式的内参基因。该研究结果为黄花大苞姜花药发育分子机制相关研究奠定了基础,也为姜科花药发育相关内参基因的选择提供了参考。

蓖麻蚕基因转录表达分析的内参基因筛选

为了筛选能够稳定表达,适合蓖麻蚕基因转录表达分析的内参基因,根据鳞翅目昆虫基因分析中常用的内参基因肌动蛋白(β-non-muscle,β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyeeraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18SrRNA、16SrRNA的序列设计特异性引物,分别对蓖麻蚕4个组织及9个不同发育时期的个体材料进行实时荧光定量PCR,制作标准曲线,采用相对定量的方法处理Ct值,结合NormFinder和geNorm软件分析以上4个候选内参基因在蓖麻蚕不同组织和不同发育时期转录表达的稳定性。结果表明:β-actin在蓖麻蚕血液、脂肪体、中肠、丝腺各组织,以及幼虫、蛹、成虫、卵各发育时期的表达最为稳定,适合作为蓖麻蚕基因转录水平研究的内参基因。

华细辛实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

选择合适的内参基因是准确分析目标基因表达水平变化的重要条件。选取SAND-1、ACT、18Sr RNA、CYP2、GAPDH、TUB 6个常用的内参基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,通过ge Norm、Norm Finder、Best Keeper、Delta CT等软件分析和评价6个候选内参基因在华细辛营养生长期、花期和花后期等不同生长阶段的根、根茎、叶片、叶柄等不同组织中的表达稳定性,筛选适宜华细辛不同生长阶段不同组织基因表达水平分析的内参基因。结果表明,18S r RNA在华细辛所有样品中表达最为稳定,是进行华细辛基因表达水平分析的适宜的内参基因。研究结果可为华细辛重要活性成分生物合成途径相关基因的功能分析,以及基因差异表达的研究提供有效的校正工具,确保基因表达分析结果的准确性与可靠性。