电转移中蛋白质的透膜现象及其对蛋白质印迹结果的影响

探讨了电转移中蛋白质的透膜现象及其对蛋白质印迹结果的影响 .采用抗凋亡抑制蛋白 Survivin的抗体 ,对细胞裂解液进行蛋白质印迹 .与常规操作方法不同之处是 :在电转移的凝胶“三明治”中 ,重叠放置两张硝酸纤维素膜 .电转移后 ,对两张膜同时进行免疫印迹 .在特定的转移条件下 ,两张膜的免疫印迹都出现了Survivin蛋白的特异印迹带 ,证实了电转移中存在着蛋白质的透膜现象 .转移时间、电流强度和蛋白质的分子质量 ,都是影响蛋白质透膜的相关因素 .电转移中蛋白质的透膜 ,可以产生“印迹复制失真”的效应 ,从而最终影响蛋白质印迹定性和定量的结果 .所得实验结果和结论 ,揭示了蛋白质印迹技术方法学中一个需要加以充分关注的问题 。

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(MIH1)基因的cDNA片段克隆和Northern印迹分析

根据其他蟹类蜕皮抑制激素的氨基酸序列设计了简并引物,运用RT PCR和RACE技术,从中华绒螯蟹(E riocheirjaponicasinensis)成体的蜕皮间期眼柄中,克隆了1条长1145bp的cDNA。该cDNA编码60个氨基酸,包括942bp的3′端非翻译区。同源性分析结果表明,该cDNA编码的氨基酸序列和其他蟹类蜕皮抑制激素有较高的一致性,最高的一致性为64%,将获得的序列命名为中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因(GenBank检索号:AY309062)。用Northern印迹分析的方法对处于各个发育阶段的胚胎及状幼体期该基因的表达进行了研究,结果表明,处于胚胎发育早期的卵裂期几乎没有检测到杂交信号,而胚胎发育的其他时期和状幼体期都检测到蜕皮抑制激素1基因的mRNA。中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因部分cDNA序列的获得为进一步获得该基因的全长cDNA、研究其功能及阐明中华螯蟹蜕皮的分子机制奠定了基础。

一种快速筛选阳性克隆的方法——反向Northern印迹杂交技术

本实验采用反向Northern印迹杂交 (reverseNorthernblot)技术 ,对经反转录差异显示PCR(differentialdisplayre versetranscriptionalPCR ,DDRT PCR)获得的 5 6个差异片段 (cDNA)进行阳性片段的初步筛选 ,获得 8个候选阳性片段 ,经Northern印迹杂交实验 ,确证 5个阳性片段。实验表明该方法是一种快速检测和筛选阳性克隆片段的方法 ,并具有简便、经济的优点。它不仅可用于各种分离差异片段的方法中差异片段的初步筛选 。

Northern杂交检测多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2在不同肿瘤细胞中的表达水平

目的:从mRNA水平检测五种不同肿瘤细胞株中多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(pp-GalNAc-T2)的表达情况。方法:采用Northern杂交方法。结果:Northern杂交结果显示了两条区带,并且pp-GalNAc-T2在不同肿瘤细胞中存在表达差异。结论:pp-GalNAc-T2基因在不同细胞存在差异表达并可能存在着剪切现象。

酶联免疫电转移印迹技术(EITB)检测抗EB病毒特异性DNA酶抗体

本研究用酶联免疫电转移印迹技术,检测血清中抗 EB 病毒特异性 DNA 酶抗体,试图建立一种可常规应用于临床的检测方法。结果表明:50例鼻咽癌患者血清中,26例在52～59KD 范围内出现由4条阳性显带融合而成的阳性反应区;健康成人和其他头颈部肿瘤患者血清无一例在此区域内出现阳性显带,表明其特异性甚高。

原子转移自由基聚合法制备表面分子印迹聚合物及性能研究

采用原子转移自由基聚合法,以二苯并噻吩为模板分子,4-乙烯基吡啶为功能单体,在SiO2表面合成了适合分离油品中二苯并噻吩的新型表面分子印迹聚合物。利用傅里叶变换红外光谱、N2吸附实验、电子扫描电镜对印迹聚合物的结构和形貌进行了表征。通过在模拟油中的静态吸附实验,对印迹聚合物的吸附性能进行了研究。结果表明,在SiO2表面成功的合成了具有多孔结构的分子印迹层,分子印迹聚合物对二苯并噻吩表现出良好的特异性识别性能,吸附动力学满足准二级动力学方程,等温线符合Freundich等温线模型,吸附热力学研究表明吸附以熵驱动为主的自发的吸热过程。

可逆加成-断裂链转移沉淀法制备对羟基苯甲酸丁酯分子印迹聚合物及其应用

采用可逆加成-断裂链转移(RAFT)沉淀聚合法,制备对羟基苯甲酸丁酯分子印迹聚合物(MIP_R),将其作为固相萃取材料,建立了化妆品中对羟基苯甲酸酯类物质的富集与检测方法。吸附实验结果表明,MIP_R对模板的结合能力高于其结构类似物,印迹效果良好,对对羟基苯甲酸酯类物质具有组选择性。同时,固相萃取实验显示,MIP_R可以选择性富集、纯化对羟基苯甲酸脂类物质,对甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的加标回收率为81.5%～96.0%,且相对标准偏差≤5.6%。方法检出限范围为0.0185～0.0334μg/g,定量限范围为0.0617～0.111μg/g。可用于复杂化妆品样品中对羟基苯甲酸酯类物质的分离检测。

Northern印迹法的改进

Ａｌｗｉｎｅ发明的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹法被广泛用于检测ｍＲＮＡ的大小和丰度，但由于其降解酶ＲＮａｓｅ广泛存在，且理化性质稳定，故在实际操作中，尤其是从组织中提取总ＲＮＡ进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹，对那些设备不是很完善的实验室来说，得到一个比较理想的杂交...

可逆加成-断裂链转移沉淀聚合法制备木犀草素分子印迹聚合物及其表征

本文以二苄基三硫代酯(DBTTC)作为可逆加成-断裂链转移(RAFT)试剂,木犀草素为模板分子,丙烯酰胺为功能单体,采用可逆加成-断裂链转移自由基聚合结合沉淀聚合法(RAFTPP)制备分子印迹聚合物。对该条件下制备的印迹聚合物(R-MIPs)与传统沉淀法制备的印迹聚合物(T-MIPs)进行吸附实验和吸附模型分析,测得吸附容量QR-MIPs为32.60mg/g,QT-MIPs为29.06mg/g。印迹聚合物主要形成二种结合位点,吸附行为符合Scatchard模型。将R-MIPs作为固相萃取填料,可用于花生壳中木犀草素的提取,效果良好。

基于表面引发原子转移自由基聚合技术制备2，4-二氯苯氧乙酸分子印迹聚合物及其识别特性分析

首次以氯甲基化交联聚苯乙烯树脂（CMCPS）为载体和大分子引发剂、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-19）为模板、丙烯酰胺（AM）为单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂、溴化铜／2，2’-联吡啶（CuBr／Bpy）为催化剂，采用表面引发原子转移自由基聚合（SI-ATRP）技术，制备了2，4-二氯苯氧乙酸分子印迹聚合物（2，4-DMIPs），并研究了模板分子与功能单体比例对该印迹聚合物吸附量的影响。通过动态、静态及竞争试验考察了该印迹聚合物对2，4-D的吸附性能。结果表明：2，4-DMIPs对模板分子2，4-D具有良好的特异性识别作用；与2，4-二氯苯酚和2，4-二氯苯甲醛相比，2，4．DMIPs对2，4-D的选择性系数分别为2．84和3．75，相对选择性系数分别为2．31和2．29。采用Scatchard模型分析，可以得到两类结合位点，计算得到最大表观吸附量（Qmax）分别为76．92和142．91mg／g，离解常数亿分别为632．91和2309．47mg／L。将2，4-DMIPs作为固相萃取剂，对豆芽样品进行添加回收试验，回收率为86％-104％，相对标准偏差（RSD）为1．9％～10％，方法的检出限为20ng／g。该印迹聚合物可以富集分离测定2，4．D，稳定性好，并且能重复使用。

日本血吸虫各期虫体的酶联免疫电转移印迹分析及抗原定位研究

本文采用酶联免疫电转移印迹技术（EITB）分析、比较日本血吸虫不同发育时期虫体特定的组分蛋白分子、雌虫、雄虫和虫卵抗原分别与相应的雌、雄虫和虫卵免疫血清反应呈现17、20和8条蛋白带，这三种抗原与其它不同时期虫体免疫血清反应，三者间及彼此间均出现交叉反应，而雌、雄虫和虫卵抗原与其它寄生虫感染血清作用没发现有叉及反应。应用间接荧光抗体试验（IFA）和免疫酶染色试验（IES）对日本血吸虫抗原进行定位研究，其结果相似。血吸虫主要抗原物质来源于成虫表皮、肠上皮和卵内的毛蚴.

Northern印迹方法的改良及其应用

目的 :简化Northern印迹的操作步骤 ,建立安全无毒的RNA凝胶电泳方法。方法 :RNA经变性处理后在不含任何化学物质的中性琼脂糖凝胶上电泳 ,然后用 0 0 5mol LNaOH溶液转印 3h至转印膜上 ,相继与特异核酸探针杂交 ,检测不同表达丰度的基因 ,放射自显影成像。结果 :凝胶电泳图显示清晰的 2 8S和 1 8SrRNA条带 ;Nothern杂交检测出低丰度表达基因。结论 :改良的Northern印迹法能够达到传统方法有效变性、分离、检测特异基因表达的效果 ,垂直凝胶电泳可检测低至 5ng的RNA。

可逆加成-断裂链转移沉淀聚合法制备噻菌灵分子印迹聚合物

采用可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合技术与沉淀聚合技术相结合的方法合成了噻菌灵分子印迹聚合物。该聚合物微粒具有更好的分散性,其印迹效果比传统沉淀聚合法得到的分子印迹聚合物更好。为从复杂的农药残留中富集和分离噻菌灵提供了可能。

应用Southern印迹杂交法检测转移基因在宿主细胞中的整合

目的 应用Southern印迹杂交法 (Southernblot)证实转移基因整合至宿主细胞基因组DNA。方法 酚氯仿法提取基因转导的PA317/AIM及K5 6 2 /AIM细胞基因组DNA ,以聚合酶链反应 (PCR)扩增转移基因片段 ;随机引物法标记3 2 P -DNA探针 ,与经BamHI酶切、琼脂糖凝胶电泳、转移至尼龙膜的基因组DNA进行Southern杂交反应 ,检测转移基因的整合。结果 PCR反应和Southernblot分析证实转移基因存在于受体细胞基因组DNA中。结论 Southern印迹杂交法证实转移基因稳定整合至逆转录病毒生产细胞PA317/AIM及靶细胞K5 6 2 /AIM中。

一种简便、高效的DNA片段转移印迹技术

核酸分子杂交是分子生物学研究中最重要的基本技术之一。其中,膜上印迹转印杂交则是最常用的一种分子杂交方法。它不仅在基因定位、定性和定量分析上极为常用,而且是分子克隆、基因突变及基因诊断上不可缺少的关键技术。当前,southern转印印迹技术虽然从经典的虹吸印迹法发展到电转印法、真空印迹法等,但仍有许多不能令人满意之处,例如:操作不便,需要特殊的仪器设备,每次转印结果仅供一次杂交之用等。为了克服上述不足,同时考虑到精简步骤和适应于教学,作者在实践中不断摸索、总结及参考国外经验,对常用的虹吸法southern印迹技术进行了改良。实验证明该方法简便、经济实用,适合基层应用。

可逆加成-断裂链转移策略制备可识别转铁蛋白的抗原决定基印迹微球

应用可逆加成-断裂链转移(RAFT)策略制备了一种抗原决定基表面印迹微球。这一工作以转铁蛋白的抗原决定基N端九肽作为模板,通过共价键合的方式固载于修饰了戊二醛的硅胶颗粒表面。然后以甲基丙烯酸、甲基丙烯酰羟乙酯为功能单体,甲叉基双丙烯酰胺为交联剂,偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂,N,N-二甲基甲酰胺为溶剂,在三硫酯试剂2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸的调控下,于70℃进行活性-可控的聚合反应,制备得到分子印迹微球。该材料对模板抗原决定基的识别容量为2.36 mg/g,印迹因子为1.89;对转铁蛋白的识别容量为4.98 mg/g,印迹因子为1.61,120 min内可达到吸附平衡;在多蛋白质竞争识别中,该材料对转铁蛋白识别的印迹因子远高于细胞色素C、乳球蛋白等其他竞争蛋白质的印迹因子。以上结果证明,通过RAFT策略制备得到的抗原决定基分子印迹材料在对抗原决定基具有良好的识别能力的同时,对模板抗原决定基对应的转铁蛋白也具有优良的选择性、较高的识别容量和较快的识别速度。

上皮细胞转化序列2通过调控p33生长抑制因子1表达影响食管鳞状细胞癌细胞的体外转移活性

目的探讨上皮细胞转化序列2(ECT2)与p33生长抑制因子1(p33ING1)的表达水平对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞转移活性的影响。方法采用免疫组织化学法和免疫印迹法检测食管鳞癌组织和癌旁组织中ECT2和p33ING1的表达情况。将人食管鳞癌细胞系KYSE140细胞分为4组:空白组、阴性对照组(pcDNA 3.1 NC)组、过表达组(pcDNA 3.1 ECT2)和抑制表达组(si ECT2)。采用MTT法和细胞集落形成实验研究细胞的增殖和生长能力,Transwell实验和划痕实验研究细胞的侵袭和迁移能力,并用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期,Western blotting检测ECT2对p33ING1蛋白的影响。结果在食管鳞癌组织中ECT2表达增加,p33ING1表达降低。过表达ECT2能够显著增加KYSE140细胞的生长、集落形成、迁移以及侵袭能力,并能降低KYSE140细胞的凋亡率和p33ING1的表达;此外,抑制ECT2表达后能够逆转上述变化。结论ECT2高表达能够促进食管鳞癌KYSE140细胞的生长、转移,并抑制其凋亡,其机制可能与ECT2能够抑制p33ING1表达相关。

超氧化物歧化酶催化-电化学调控的原子转移自由基聚合方法制备分子印迹聚合物

病理学中对含金属蛋白质的敏感检测极其重要。本文以超氧化物歧化酶(SOD)作为金属蛋白,SOD既作为模板分子又作为催化剂进行电化学调控的原子转移自由基聚合(e ATRP)反应制备蛋白质印迹聚合物(PIPs),用于SOD电化学生物传感器。该方法不需要过渡金属离子,具有制备简单、节约试剂、保护环境等优点。我们选用L-半胱氨酸和纳米金修饰的金电极(Au/L-cys/nano Au)作为工作电极将氧化型SOD催化还原为还原型SOD,利用还原型SOD的Cu (Ⅰ)粒子,在引发剂4-硫苯基-2-溴-2-甲基丙酸酯(4-mercaptophenyl2-bromo-2-methylpropanoate,4-HTP-Br)修饰的金电极上调控丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺的e ATRP聚合制备SOD PIPs。利用循环伏安法(CV)和X射线光电子能谱(XPS)方法对其进行了表征。通过微分脉冲伏安法(DPV),在最优的条件下利用此修饰电极对溶液中的SOD进行检测,线性响应范围为1. 0×10-7～1. 0×102mg/L,检测限为6. 8×10-8mg/L(S/N=3),相关系数为0. 995。与其它检测SOD的方法相比,该方法具有更宽的线性范围和较低的检测限。本研究对于制备PIPs,用蛋白质催化的e ATRP和含金属蛋白的敏感检测均有重要意义。

转移缓冲液对蛋白质印迹的影响

利用三种转移缓冲液 ,分别以半干和湿转法 ,检测癌基因产物Bcl 2 ,并获得不同强度的印迹结果 .不含SDS的转移缓冲液转移效果明显优于含SDS的转移缓冲液 ,且SDS含量越高印迹带越弱 ;此外 ,半干转移与湿转相比 ,可大大缩短转移时间 。

原子转移自由基聚合法合成7-乙酰氧基-4-甲基香豆素分子印迹聚合物及吸附性能研究

以黄曲霉毒素结构类似物7-乙酰氧基-4-甲基香豆素为替代模板,甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体,氯化苄为引发剂,氯化亚铜为过渡金属卤化物,2,2-联吡啶为配体,利用原子转移自由基聚合法合成分子印迹聚合物,通过一系列实验对其合成条件进行优化;对聚合物进行表征,并对其吸附黄曲霉毒素的能力进行研究。通过单因素实验和正交试验,得到最佳的合成条件:模板与功能单体的物质的量比为1∶80,引发剂的量为1.5%(单体的质量百分比),反应温度为60℃,过渡金属卤化物与配体的物质的量比为1∶3。在最优的合成条件下合成分子印迹聚合物,并将其作为填充材料制作固相萃取柱,用于选择性分离样品中的黄曲霉毒素,并与商品柱对比。