人参中miRNA的提取和鉴定分析

[目的]通过Northern印迹杂交(Northern blot)验证人参中微小核糖核酸(miRNA)的存在。[方法]根据已知人参miRNA序列设计合成2条特异LNA反义寡核苷酸探针,并用地高辛标记。采用通用植物miRNA提取试剂盒提取新鲜人参Total RNA,15%变性PAGE电泳分离小RNA并检测。[结果]Northern blot表明,人参miR482和miR1439等2种miRNA均有表达。[结论]验证了人参中miRNA的存在,为研究人参的疗效机制、临床应用和剂型开发等提供新思路。

棉花线粒体atp9基因的克隆和转录研究获取渠道分析

以三系杂交棉胞质雄性不育系P30A、保持系P30B和恢复系Y18为材料,通过Tail-PCR从可育胞质获得线粒体atp9基因序列,并利用Northern blot分析了atp9基因在棉花幼蕾的的转录情况。结果显示:在三系中atp9基因均存一个0.5 kb的强杂交带和一个1.0 kb的弱杂交带,杂交结果无明显差异;三系中atp9基因编码区共有7个编辑位点,第7个编辑位点密码子由于编辑转变为终止密码子使翻译提前终止;atp9基因在保持系中幼蕾的编辑频率要明显低于不育系和恢复系;发现atp9基因的编辑与棉花胞质形式相关,而且不同的核背景也会影响编辑率,推测线粒体atp9基因与棉花的胞质雄性不育具有一定的相关性,但有待更进一步分析。

Northern Blot法分析高浓度TSH诱导甲状腺细胞c-fos的表达

近年研究结果已在分子水平上认识到原癌基因不仅可致肿瘤形成,其对正常细胞的生长、分化、增殖、信息传递及内分泌细胞的分泌都具有极其重要的作用。c-fos是其中一种核内蛋白类原癌基因,可被激素等快速而短暂地激活。由于它是转录激活因子的组成成份。

大鼠自发性高血压和心肌肥厚时热休克蛋白70基因表达的研究

本工作采用热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）核酸分子杂交方法，检测了自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）与其正常对照（ＷＫＹ）大鼠离体培养的主动脉平滑肌细胞（ＡＳＭＣ）受热刺激后以及大鼠腹主动脉缩窄后心肌肥厚时左心室ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ的水平，并对ＳＨＲ和ＷＫＹ肝组织基因组ＤＮＡ进行了限制性酶切片断长度多态性（ＲＦＬＰ）分析。结果表明：ａ．３７℃培养的ＳＨＲＡＳＭＣ及整体ＳＨＲ肝组织ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ的基础表达水平均低于ＷＫＹ大鼠，ＳＨＲＡＳＭＣ受热刺激（４２℃１５ｍｉｎ）后２ｈ，ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ表达增加的程度明显大于ＷＫＹ大鼠。ｂ．大鼠腹主动脉缩后造成左室压力超负荷，左心室ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ在压力超负荷４ｈ时已明显升高，１ｄ、２ｄ、１ｗ均维持在高水平，１ｗ后逐渐降低。ｃ．ＳＨＲ和ＷＫＹ鼠肝组织基因组ＤＮＡ经ＢａｍＨＩ酶切后，ＳＨＲＨＳＰ７０基因缺失一条约５．６ｋｂ的片段。提示：ＳＨＲＡＳＭＣ对热敏感性增加；压力负荷增加早期，左心室ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ表达明显增加；ＨＳＰ７０基因结构异常可能与高血压发生有关。

大鼠心肌肥厚时心脏心钠素、ras癌基因的表达

心钠素是由心肌细胞合成和分泌的一种循环激素，具有强大的利钠、利尿、舒张血管、抑制肾素—血管紧张素系统等作用，在高血压、心肾功能不全等疾病的发病过程中具有重要作用。本工作采用分子杂交技术，研究了心室超负荷、高血压心肌肥厚时，大鼠心肌心钠素基因以及ｒａｓ癌基因的表达。实验证明：ａ，部分结扎肾动脉上方的腹主动脉可明显升高血压和左心室／体重比值；血浆心钠素水平可由未结扎时的１２７．００士２１．８ｐｇ／ｍｌ升至结扎１周时的４６１．１０士１０２．９０ｐｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０１）。ｂ．Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ结果发现，心房心钠素ｍＲＮＡ在腹主动脉部分结扎后１周内没有明显的改变，两周时明显升高；心室心钠素ｍＲＮＡ在结扎１周时开始出现，４周时达到高峰。牛磺酸可明显促进心室心钠素ｍＲＮＡ的表达，肼苯哒嗪则明显抑制心室心钠素的转录。ｃ．应用心钠素限制性内切酶片段长度多态性分析，还发现遗传性高血压大鼠的染色体ＤＮＡ应用ＰｓｔＩ酶切后，较ＷＫＹ大鼠缺失一条３．０ｋｂ的片段。ｄ．部分结扎腹主动脉或注射α－肾上腺素能受体激动剂—新福林，可促进心肌ｒａｓ癌基因的转录。这种增加在结扎后４小时内即可发生，且可持续３周以上。其ｒａｓｍＲＮＡ的变化?

斜纹夜蛾GST基因的原核表达载体构建、融合蛋白表达及Northern印迹分析

谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是生物体内重要的解毒酶系之一。根据斜纹夜蛾(Spodoptera litura)GST基因设计特异引物,从cDNA文库中扩增GST基因并克隆至pGEM-T载体,经鉴定后经SpeⅠ和EcoRⅠ双酶切后,与表达载体pPROEX HTb连接,转化感受态细胞E.coliDH5α,经PCR鉴定和双酶切鉴定得到阳性重组质粒pPROEX HTb-GST,在IPTG诱导下,获得融合蛋白的表达。经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定,表达产物为25KD的GST融合蛋白。Northern杂交结果表明,2龄期斜纹夜蛾GST基因在mRNA水平上的表达量最大,3龄期次之,5龄期时的表达量最小。

RNA电泳结果和Northern blot效果的关系探讨

对ＲＮＡ电泳结果和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ效果的关系进行探讨。

Northern Blot分析与原位杂交对大鼠腹腔巨噬细胞TNF－αmRNA检测的比较

本文比较了Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ与原位杂交对大鼠腹腔巨噬细胞（Ｍ）ＴＮＦ－αｍＲＮＡ的检测结果。对照组Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ为阴性，而原位杂交则见胞浆内有一定量ＴＮＦ－αｍＲＮＡ存在；ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）刺激组，则两种方法均显示Ｍ转录ＴＮＦ－αｍＲＮＡ明显增多。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ可对此作定量比较，而原位杂交则显示该ｍＲＮＡ在核周围相对较密。两种方法结合，可互相取长补短，以利更好、更全面地观察、分析某种基因变化。

过氧化苯甲酰对小鼠皮肤表皮鸟氨酸脱羧酶mRNA表达的影响

过氧化苯甲酰是一种可产生自由基、具有促癌活性的化合物。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析研究表明，ＢＰＯ在４０ｍｇ一次局部涂用于小鼠皮肤后，皮肤表皮鸟氨酸脱羧酶（ＯＤＣ）ｍＲＮＡ水平在涂用ＢＰＯ后６小时左右升至最高，而ＢＰＯ多次涂用，也可增加ｍＲＮＡ水平，并以第６小时最明显。提示，ＢＰＯ可能通过促进ＯＤＣｍＲＮＡ表达、增加ＯＤＣ酶量以诱导ＯＤＣ活性。

Ca^(2+)依赖性磷脂酶A_2有效表达系统的构建

为了构建Ca2 +依赖性磷脂酶A2 (CalciumdependentphospholipaseA2 ,cPLA2 )的有效表达系统 ,本实验应用SalⅠ消化cPLA2 -PMT2 重组体 ,电洗脱法回收cPLA2 片段并使其平末端化。应用NotⅠ消化PRC/CMV载体使其线性化 ,之后脱磷酸以防止自身环化。cPLA2 与线性化且脱磷酸载体PRC/CMV进行平末端连接 ,转染鼠巨噬细胞 ,扩增培养 ,收集细胞 ,提取RNA ,Northernblot检测cPLAmRNA。结果表明 :PRC/CMV可以做为cPLA2 cDNA的有效表达载体 ,cPLA2 -PRC/CMV表达系统的成功构建为研究各种因素对cPLA2