Notch信号通路中受体及配体在胃癌组织中的表达及意义

目的 :检测了Notch信号通路中各受体及配体在胃癌中的表达,探讨Notch信号通路在胃癌发生发展中的作用。方法 :应用实时荧光定量PCR法检测了NOTCH1/2/3/4、JAG1/2、DLL1/3/4在12例正常胃黏膜组织中的表达情况及在胃癌组织中的异常表达情况;应用免疫印迹法检测了NOTCH1在对应胃癌/癌旁组织中的表达。结果 :在正常组织中受体NOTCH2和配体JAG1的表达水平较高,其余表达水平较低;在胃癌组织中,NOTCH1/3/4和JAG2的表达水平明显提高,而其他受体和配体的表达水平变化不明显。NOTCH1蛋白在胃癌组织中的表达较癌旁组织明显增高。结论:Notch信号通路中部分受体及配体在胃癌组织中表达明显提高,Notch信号通路参与了胃癌的发生发展。

YB-1通过激活Notch受体信号通路抑制肺鳞癌细胞凋亡研究

目的探讨肺鳞癌中YB-1是否通过激活Notch受体信号通路发挥凋亡抑制作用。方法将YB-1干扰质粒pYr-1.1-YB-1-shRNA和野生表达质粒pYr-ads-1-YB-1分别转染肺鳞癌细胞株SK-MES-1,Western blot检测YB-1、RT-PCR检测Notch受体信号通路靶基因Hes1的表达;pYr-ads-1-YB-1瞬时转染SK-MES-1细胞,DAPT抑制Notch受体信号通路,Annexin V-PI双染法检测凋亡。结果 (1)YB-1可正调控Notch受体信号通路靶基因Hes1的转录;(2)YB-1过表达可显著抑制顺铂诱导的凋亡,DAPT抑制Notch受体信号通路后解除了YB-1的凋亡抑制作用。结论 YB-1可通过激活Notch受体信号通路抑制肺鳞癌细胞凋亡。

重组腺病毒过表达Notch1受体胞内结合域(NICD1)外源性激活Notch信号通路

目的:构建Notch1受体胞内结合域(Notch1 intracellular domain,NICD1)的重组腺病毒AdNICD1,探讨外源性过表达AdNICD1对Notch信号通路激活的影响。方法:利用高保真PCR(high fidelity PCR,Hi-Fi PCR)扩增NICD1编码区,并通过Gibson Assembly方法将其克隆至腺病毒载体中,经过菌落PCR、测序鉴定后,在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,再次通过质粒PCR鉴定,然后运用PacⅠ酶切线性化后用重组腺病毒载体转染过表达pTP基因的人胚肾293细胞(human embryo kidney 293 cell line,HEK293)中进行包装,收取病毒后使用过表达pTP基因的HEK293细胞扩增重组腺病毒AdNICD1。运用AdNICD1感染脂肪来源的间充质干细胞(immortalized multipotent adipose-derived mesenchymal stem cells,iMAD),检测病毒感染效率;通过Q-PCR检测NICD1和Notch下游基因表达情况;利用Westernblot检测NICD1在蛋白水平的表达情况。结果:成功构建过表达NICD1的重组腺病毒并有效感染iMAD;利用AdNICD1可明显增加NICD1在基因和蛋白水平的表达,并激活Notch信号下游基因的表达。结论:成功构建过表达NICD1的重组腺病毒,并有效激活Notch信号通路。

Notch信号通路相关受体及配体在复发性流产患者绒毛及蜕膜组织中的表达

目的:研究Notch信号通路相关受体Notch1、Notch2、Notch3、Notch4及配体Delta样典型Notch配体1、3、4(DLL1、DLL3、DLL4)、Jagged1、Jagged2在复发性流产(RSA)患者绒毛及蜕膜组织中的表达情况。方法:收集行人工流产术的RSA患者(RSA组)及正常早孕终止妊娠患者(正常组)绒毛及蜕膜组织标本各15例,并提取组织中总RNA及蛋白,实时定量PCR(qRT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)法检测两组绒毛及蜕膜组织中Notch1、Notch2、Notch3、Notch4及DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2在mRNA及蛋白水平的表达情况。结果:与正常组相比,RSA组绒毛中Notch1、Notch2、Notch4、DLL4、Jagged1、Jagged2在mRNA及蛋白水平表达均降低(均P<0.01),Notch3、DLL1、DLL3在两组间表达水平比较无统计学差异(均P>0.05);与正常组相比,RSA组蜕膜中Notch1、Notch2、Notch4、DLL1、DLL4、Jagged1、Jagged2在mRNA及蛋白水平表达均降低(均P<0.01),Notch3、DLL3在两组间表达水平表达比较无统计学差异(均P>0.05)。结论:Notch信号通路部分相关受体及配体在RSA患者绒毛及蜕膜组织中呈现病理性差异表达,提示Notch信号通路与RSA发病相关,从妊娠建立伊始即参与了RSA发生。

miR-34a通过Notch1信号通路对肺癌干细胞的抑制

背景:已有报道证实mi R-34a对肺癌干细胞有一定的抑制作用,但是其作用机制目前还不清楚。目的:探索mi R-34a对肺癌干细胞的抑制作用及机制。方法:应用免疫磁珠分选细胞技术从肺腺癌A549细胞系中分离出CD133+肺癌干细胞;脂质体转染技术构建miR-34a过表达的肺癌干细胞;双荧光素酶报告基因分析miR-34a与Notch1的靶向关系;基因敲除Notch1并检测其对肺癌干细胞的影响。结果与结论:(1)经过免疫磁珠分选和流式细胞术检测得到高比率的CD133+肺癌干细胞;(2)qR T-PCR检测发现miR-34a在CD133+肺癌干细胞中的表达明显低于CD133-肺癌细胞;(3)成功构建miR-34a过表达的肺癌干细胞,发现miR-34a能够抑制肺癌干细胞的增殖,诱导细胞凋亡;(4)双荧光素酶报告基因分析证明Notch1与miR-34a具有靶向关系;(5)基因敲除Notch1显著抑制肺癌干细胞的增殖,诱导细胞凋亡;(6)结果提示,miR-34a可能通过抑制Notch1信号通路来抑制肺癌干细胞的生长。

桃叶珊瑚苷通过调节PD-1/PD-L1信号通路介导的免疫逃逸对肺癌细胞放疗敏感性的影响

目的探究桃叶珊瑚苷(Aucubin)通过调节程序性死亡受体-1(PD-1)/程序性死亡受体配体-1(PD-L1)信号通路介导的免疫逃逸对肺癌细胞放疗敏感性的影响及其作用机制。方法0~300μmol/mL的Aucubin处理人肺癌细胞NCI-H1299,MTT检测细胞活力。将细胞分为正常对照组(Control组)、放疗组(6 Gy组)、Aucubin组、Aucubin+放疗组(Aucubin+6 Gy组),克隆形成实验和Edu实验检测细胞增殖水平,流式细胞仪检测细胞凋亡,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养液上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-2水平,蛋白质印迹法(Western blot)检测PD-1、PD-L1蛋白表达。建立肺癌小鼠移植瘤模型,分为对照组(Control组)、放疗组(5 Gy组)、Aucubin组和Aucubin+5 Gy组。测量移植瘤体积与质量,ELISA检测TNF-α、IFN-γ、IL-2水平,Western blot检测PD-1、PD-L1蛋白表达。结果与0μmol/mL比较,25~125μmol/mL的Aucubin能降低细胞活力,选择100μmol/mL的Aucubin进行后续实验。与Control组比较,6 Gy组和Aucubin组细胞克隆形成数、Edu阳性率、TNF-α水平及PD-1、PD-L1蛋白表达水平降低(P<0.05),细胞凋亡率及IFN-γ、IL-2水平升高(P<0.05);Aucubin+6 Gy组细胞克隆形成数、Edu阳性率、TNF-α水平及PD-1、PD-L1蛋白表达水平低于6 Gy组和Aucubin组(P<0.05),细胞凋亡率及IFN-γ、IL-2水平高于6 Gy组和Aucubin组(P<0.05)。小鼠移植瘤实验表明,与Control组比较,5 Gy组和Aucubin组小鼠移植瘤体积和质量、TNF-α水平及PD-1、PD-L1蛋白表达水平降低(P<0.05),IFN-γ、IL-2水平升高(P<0.05);Aucubin+5 Gy组小鼠移植瘤体积和质量、TNF-α水平及PD-1、PD-L1蛋白表达水平低于5 Gy组和Aucubin组(P<0.05),IFN-γ、IL-2水平高于5 Gy组和Aucubin组(P<0.05)。结论Aucubin可能通过阻断PD-1/PD-L1信号通路介导的免疫逃逸增强肺癌细胞放疗敏感性。

TNF-α抑制剂通过激活Notch1信号通路治疗创伤后心肌再灌注损伤的实验研究

目的探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抑制剂（依那西普）通过跨膜蛋白受体Notch1信号通路对小鼠创伤性心肌损伤的保护作用。方法选取c57系清洁级雄性小鼠36只（10-12周龄）,采用随机数字表法分为假手术组（腹腔注射5 ml/kg生理盐水）、对照组（腹腔注射5 ml/kg生理盐水）、依那西普组（建立创伤后心肌缺血再灌注损伤模型,依那西普8 mg/kg）各12只,采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组小鼠再灌注30 min后的血浆TNF-α、3 h后的血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）浓度,测定各组再灌注24 h后的左室射血分数（LVEF）、采用TUNEL染色法检测各组心肌细胞凋亡率、采用TTC双染色检测各组心肌梗死面积比值,采用免疫印迹法（Western-blot）检测再灌注6 h后心肌跨膜蛋白受体Notch1胞内活性片段（Notch1-ICD）、细胞凋亡相关蛋白3（caspase-3）的表达。结果对照组、依那西普组大鼠的血浆TNF-α、血清cTnI水平、心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白表达水平、心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积比值均显著高于假手术组（P〈0.05）;依那西普组血浆TNF-α、血清cTnI水平、心肌caspase-3蛋白表达水平、心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积比值显著低于对照组（P〈0.05）,Notch1-ICD蛋白表达水平、LVEF值显著的高于对照组（P〈0.05）。结论 TNF-α抑制剂对创伤后心肌缺血再灌注损伤心肌具有保护作用,其作用机制与激活Notch1信号通路以调节caspase-3蛋白表达水平有关。

脑缺血损伤中Notch信号通路活性的非配体依赖性改变及其作用

目的观察脑缺血损伤Notch信号转导通路的非配体依赖性活性变化及其对缺血损伤的影响。方法建立神经元样PC12细胞氧糖剥夺(OGD)模型模拟脑缺血损伤。OGD 12 h行Notch1-siRNA,实时PCR技术检测Notch1 mRNA表达,Western印迹技术检测Notch1、Notch1胞内段NICD蛋白表达,流式细胞仪检测Notch1-siRNA对缺血损伤细胞凋亡率。结果 OGD组Notch1 mRNA表达较正常对照组显著升高,OGD+Notch1-siRNA组较OGD组显著降低(P<0.05);OGD组Notch1及NICD蛋白表达较正常对照组均显著升高,OGD+Notch1-siRNA组较OGD组显著降低(P<0.05);OGD+Notch1-siRNA组细胞凋亡率较OGD组显著升高(P<0.05)。结论缺血性脑损伤可诱导非配体依赖性的Notch1信号转导通路活化,其可能在脑缺血特定时程发挥抗凋亡脑保护作用。

程序性死亡受体1及其配体信号通路在哮喘发病机制中的作用

支气管哮喘是一种气道炎症性疾病,其发病机制尚未完全明确。流行病学资料显示:哮喘的发病率逐年升高,给家庭和社会带来了沉重的经济负担。细胞程序性死亡受体1(PD-1)是免疫球蛋白超家族的一员,与配体PD-L1或PD-L2协同负调节宿主免疫反应,阻断PD-1/PD-Ls信号通路能激活宿主免疫系统。PD-1是调节T细胞(Treg)激活T细胞的关键受体,PD-L1能直接参与Treg细胞的产生,Tregs通过PD-1/PD-Ls信号通路介导哮喘的气道炎症和调节气道高反应性(AHR);PD-1/PD-Ls信号通路能通过iNKT细胞介导哮喘的发生,也能通过抑制Th17细胞活性减轻哮喘的严重程度;PD-L2既能与PD-1结合抑制T细胞,减少Th2细胞因子的产生,也可以独立PD-1/PD-Ls信号通路的方式促进气道高反应性。PD-L2能通过Th9细胞(不同的T细胞亚群)介导哮喘的发生。本文就PD-1及其配体信号通路在哮喘机制中的作用作一综述。

白藜芦醇对非酒精性脂肪性肝病小鼠Notch1信号通路的影响

目的基于Notch1信号通路探讨白藜芦醇对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的影响。方法选取10只C57BL/6J雄性小鼠作为正常组,给予普通饲料喂养;另取30只C57BL/6J雄性小鼠给予高脂饲料喂养12周建立NAFLD模型,将建模成功的小鼠随机分为3组各10只。白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组分别给予50 mg/(kg·d)和100 mg/(kg·d)白藜芦醇灌胃,高脂组和正常组给予生理盐水灌胃,均1次/d,连续灌胃6周。灌胃结束后,测定各组小鼠血清三酰甘油(TC)、总胆固醇(TG)水平;HE染色观察肝脏组织病理改变;油红染色观察肝脏脂肪沉积情况;RT-qPCR法检测各组小鼠肝脏组织中固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)和过氧化物酶增殖物激活受体α(PPAR-α)mRNA表达情况;蛋白质印迹法检测各组小鼠肝脏组织中Notch1表达情况。结果高脂组小鼠血清TG、TC水平均明显高于正常组(P均<0.05);白藜芦醇低、高剂量组小鼠血清TG、TC水平均明显低于高脂组(P均<0.05),白藜芦醇高剂量组均明显低于白藜芦醇低剂量组(P均<0.05)。HE染色显示,高脂组小鼠肝细胞结构紊乱,有坏死现象,肝细胞脂滴空泡较多;白藜芦醇低、高剂量组小鼠肝坏死细胞和脂肪空泡较少;油红染色显示,高脂组小鼠肝脏橘红色脂滴沉积较多,白藜芦醇低、高剂量组小鼠橘红色沉积较少。与正常组比较,高脂组小鼠肝脏组织中SREBP-1c mRNA和Notch1蛋白相对表达量均明显增高(P均<0.05),PPAR-αmRNA相对表达量明显降低(P<0.05);与高脂组比较,白藜芦醇低、高剂量组小鼠肝脏组织中SREBP-1c mRNA和Notch1蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),PPAR-αmRNA相对表达量均明显增高(P均<0.05),且白藜芦醇高剂量组各指标改善较白藜芦醇低剂量组明显(P均<0.05)。结论白藜芦醇能够改善NAFLD病理改变,其机制可能与抑制Notch1信号通路进而减少肝脏脂肪合成有关。

ERα通过Notch1信号通路刺激NCI-H23细胞增殖

为了探讨Notch1信号通路在ERα诱导NCI-H23增殖中的作用,将NCI-H23非小细胞肺癌细胞经E2、DATP或siRNA干预后,采用MTT、细胞集落分析、PI分析、western blotting的方法检测细胞的增殖和蛋白表达变化.结果与空白对照相比E2使细胞增殖能力加强,处于增殖期细胞比例是对照组的1.33倍,Bcl-2和PCNA表达增加,Bax表达减少;DATP合并E2处理后细胞增殖能力明显下降,与E2作用组相比P<0.01,增殖期细胞比例是E2组的0.66倍,Bax表达明显增加,细胞生存能力下降;当siRNA沉默Notch1表达后E2再刺激使细胞ERα表达明显低于转染control siRNA组,E2在Notch信号减弱后对细胞增殖的刺激作用被削弱.得出了E2刺激细胞增殖需要Notch信号参与,减少Notch信号传导可以抑制E2对细胞的促增殖作用的结论.

斑马鱼Notch信号通路配体基因delta-like4对smad基因的调控作用

为研究斑马鱼(Danio rerio)的Notch信号通路配体delta-like 4(dll4)对smad基因(smad1和smad7)的调控作用,利用qRT-PCR方法检测受精后2 d(day post fertilization,dpf)的斑马鱼dll4纯合突变体smad家族中smad1和smad7的表达变化,利用生物信息学软件预测smad1和smad7启动子序列的转录结合位点和CpG岛;采用同源重组的方法,构建p3×Flag-CMV-dll4真核表达载体及pGL3-smad1-Luc和pGL3-smad7-Luc报告基因载体,并通过双荧光素酶试验检测dll4对smad1和smad7的调控活性;分别转染两种启动子报告基因载体到HEK293T细胞,共转染启动子报告基因载体与真核表达载体到HEK293T细胞。结果表明:dll4纯合突变体斑马鱼中smad1和smad7表达量均显著下调(P<0.0001);两种基因启动子均包含HNF-3、GATA-1和Oct-1等转录因子结合位点,只有smad7启动子存在CpG岛;报告基因pGL3-smad1-Luc和pGL3-smad7-Luc的活性分别为对照组的7.3倍和142.7倍,两种报告基因与p3×Flag-CMV-dll4表达载体共转后,转录活性均升高,分别为对照组的2.8倍和2.2倍,说明p3×Flag-CMV-dll4可以促进pGL3-smad1-Luc和pGL3-smad7-Luc的转录表达活性。研究表明,斑马鱼Notch信号通路配体基因dll4可通过smad基因家族在血管生成中发挥调控作用,为损伤血管的修复和肿瘤血管生成提供特异的生物学靶点。

基于Notch-1信号通路上调miR-191对甲状腺癌细胞的干预作用

目的探究基于人跨膜受体蛋白(Notch)-1信号通路研究上调微小RNA-191(miR-191)对甲状腺癌细胞的干预作用。方法购买甲状腺癌8505C细胞株,常规培养后分为空白组、下调组、上调组,空白组加入常规细胞培养液做空白处理,下调组加入miR-191 inhibitor行下调转染,上调组加入miR-191 mimics行上调转染。检测各组细胞转染情况,细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力及Notch-1信号通路蛋白表达量。结果与下调组相比,上调组miR-191表达量显著较高(P<0.05)。与下调组相比,上调组24、48、72 h细胞增殖率显著较低,72 h细胞凋亡率显著较高(P<0.05)。与下调组相比,上调组细胞迁移、侵袭数量显著较少(P<0.05)。与下调组相比,上调组Notch-1、Split多毛增强子(HES)5、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)表达量显著较高,Bcl-2表达量显著较低(P<0.05)。结论上调miR-191可能通过活化Notch-1信号通路,上调Notch-1、HES5、Bax表达量,下调Bcl-2表达量,从而起到抑制细胞增殖、迁移、侵袭活动,促进细胞凋亡。

Notch信号通路对周围T淋巴细胞活性及分化的调控作用

Notch是一种物种间表达高度保守的跨膜蛋白受体,其在胚胎及出生后个体的生长发育中起重要的调节作用。Notch首次在果蝇中被发现,因其功能缺失后果蝇翅膀产生缺口而得名。在哺乳动物中,Notch受体有4种：Notch1-Notch4,其配体分为Delta like与Jagged两类,前者包括Delta1、Delta3、Delta4或DLL1、DLL3、DLL4,后者包括Jagged1和Jagged2。

β淀粉样肽对神经母细胞瘤细胞Notch信号通路的影响

目的:研究β淀粉样肽(Aβ)处理SH-SY5Y细胞以及α3神经型尼古丁受体(α3 nAChR)沉默细胞后细胞Notch信号通路的变化。方法:2μmol/L Aβ处理SH-SY5Y细胞以及α3 nAChR沉默细胞,用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real Time PCR)和蛋白印迹(western blot)方法分别检测细胞中Notch信号通路中Notch1和Hes1的mRNA及蛋白水平的变化,评价Aβ对细胞Notch信号通路的影响。结果:Aβ处理的SH-SY5Y细胞以及α3 nAChR沉默细胞中Notch1和Hes1的mRNA及蛋白水平表达均增加,且在α3 nAChR沉默细胞中增加更为明显,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Aβ可增加细胞Notch信号通路基因表达,α3 nAChR沉默会增强Aβ对Notch信号通路基因表达的影响,这可能与阿尔茨海默氏病(AD)的发病有一定的关系。

弥漫大B细胞淋巴瘤中铁死亡相关基因的表达及其与免疫细胞和信号通路的关系

目的通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)中铁死亡相关基因的表达及其与程序性死亡受体配体-1(programmed death ligand-1,PD-L1)和免疫细胞的关系,为DLBCL的治疗提供新的靶标。方法通过TCGA数据库查找获得22个铁死亡相关基因。从TCGA数据库获取48例DLBCL(DLBCL组)及54例反应性淋巴结增生患者(对照组)淋巴结标本的铁死亡相关基因以及PD-L1的表达数据。使用Wilcoxon秩和检验进行组间差异性表达分析。基因表达相关性分析采用Spearman相关性分析。采用R软件包pheatmap分析DLBCL中铁死亡相关基因表达与免疫细胞的相关性。采用R软件GSVA包分析铁死亡相关基因表达与磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B-mammalian target of rapamycin,PI3K-Akt-mTOR)信号通路的相关性。结果DLBCL中周期素依赖性激酶抑制因子1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A)、70 kDa热休克蛋白5(heat shock 70 kDa protein 5,HSPA5)、内质膜蛋白复合体亚基2(endoplasmic membrane protein complex subunit 2,EMC2)、溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7,member 11,SLC7A11)、金属硫蛋白1G(metallothionein 1G,MT1G)、热休克蛋白B1(heat shock protein B1,HSPB1)、谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase4,GPX4)、范可尼贫血互补群D2(Fanconi anemia complementary group D2,FANCD2)、柠檬酸合成酶(citrate synthase,CS)、CDGSH铁硫结构域1(CDGSH iron sulfur domain 1,CISD1)、法尼基二磷酸法尼基转移酶1(farnesyl diphosphate farnesyltransferase 1,FDFT1)、SLC1A5、转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFRC)、核糖体蛋白L8(ribosomal protein L8,RPL8)、核受体共激活因子4(nuclear receptor coativator 4,NCOA4)、二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidaseⅣ,DPP4)和花生四烯酸15脂氧合酶(arachidonate-15-lipoxygenase,ALOX15)基因表达均上调(均P<0.05)。免疫细胞相关分析显示,铁死亡相关基因可激活体内巨噬细胞M1(P<0.05)。DLBCL中长链脂酰辅酶A合成酶4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4)、CDKN1A、DPP4、EMC2、谷氨酰胺酶2(glutaminase 2,GLS2)、HSPA5、溶血卵磷脂酰基转移酶3(lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)、MT1G、NCOA4、红细胞衍生核因子2样蛋白2(nuclear factor erythroid 2-like-2,NFE2L2)、精脒/精胺N1-乙酰基转移酶1(spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1,SAT1)、SLC7A11和TFRC这些铁死亡相关基因的表达均与PD-L1表达呈正相关(均r>0.4,均P<0.05)。铁死亡相关基因LPCAT3、NCOA4和TFRC的表达均与PI3K-AktmTOR通路呈正相关(均r>0.4,均P<0.05)。结论多数铁死亡相关基因在DLBCL组织中高表达,且与PD-L1、免疫浸润及PI3K-Akt-mTOR通路有关。

罗米司亭对血小板减少性紫癜小鼠BMNC中Notch信号以及PBMC中GATA-3和PD-1表达的影响

目的探究罗米司亭对血小板减少性紫癜(ITP)小鼠骨髓单个核细胞(BMNC)中Notch信号通路,以及外周血单个核细胞(PBMC)中转录因子结合蛋白-3(GATA-3)和程序性细胞死亡受体-1(PD-1)水平的影响。方法48只小鼠随机均分为对照组、ITP组和罗米司亭组。腹腔注射抗血小板抗体建立ITP模型,罗米司亭组皮下注射罗米司亭2μg/kg。分别检测3组小鼠的血小板计数变化情况。使用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western blot、流式细胞术检测BMNC中Notch和Jagged1,以及PBMC中GATA-3和PD-1水平。结果建模后小鼠血小板计数显著降低(P<0.05),罗米司亭干预第7天和第14天罗米司亭组血小板计数显著高于ITP组(P<0.05)。建模后小鼠BMNC中Notch信号通路表达水平显著升高(P<0.05),罗米司亭组Notch、Jagged1蛋白和mRNA表达水平显著低于ITP组(P<0.05)。建模后小鼠GATA-3 mRNA和PD-1水平显著降低(P<0.05),罗米司亭组GATA-3 mRAN和PD-1水平显著高于ITP组(P<0.05)。结论罗米司亭可提高ITP小鼠血小板计数,并且抑制BMNC中Notch信号通路表达水平,上调PBMC中GATA-3和PD-1表达。

ERK信号通路对钛合金诱导成骨细胞RANKL、OPG表达的作用

目的探讨钛合金颗粒对体外培养的小鼠成骨细胞核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）及骨保护素（OPG）基因表达和蛋白分泌的影响，以及细胞外信号调控激酶1／2（ERKl／2）信号通路在其中的作用。方法体外培养成骨细胞。实验分3组：对照组（A组）；钛合金组（B组）：给予浓度为0．1g／L钛合金颗粒干预；抑制剂组（c组）：给予钛合金颗粒＋ERK信号通路抑制剂P1）98059，每组6个样本。采用RT—PCR和ELISA法分别检测成骨细胞RANKL、OPG基因和蛋白表达。结果3组各个时间点均可见RANKL、OPG的表达；但B组RANKL、OPGmRNA的表达和蛋白分泌量以及RANKL／OPG比值显著高于A组（P〈0．01）；而c组RANKL、OPGmRNA的表达和蛋白分泌水平以及RANKL／OPG比值的增幅显著小于B组（P〈0．01）。结论钛合金颗粒可刺激成骨细胞RANKLmRNA、OPGmRNA的表达并促进RANKL、OPG蛋白的分泌，增加RANKL／OPG比值；ERK信号通路抑制剂PD98059可一定程度抑制RANKL和OPG的表达，降低RANKL／OPG比值，对减少假体周围骨溶解的发生可能起重要作用。

程序性死亡受体1及其配体信号通路对心肌缺血再灌注损伤的影响机制

目的探讨程序性死亡受体1及其配体信号通路对心肌缺血再灌注损伤影响以及机制。方法采用随机数字表法将20只8~10周龄C57BL小鼠,分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/RI组),I/RI+CPG-ODN组和程序性死亡因子配体1(PD-L1)单抗处理组(I/RI+PD-L1组),每组5只,送单细胞测序,检测白细胞介素(IL)-2、IL-6、γ-干扰素(IFN-γ),蛋白印迹法检测组织中PD-L1、细胞凋亡蛋白B细胞淋巴瘤白血病-2(bcl-2)及bcl-2相关X蛋白(bax)的蛋白表达;将H9C2心肌细胞随机分为正常对照组(Control组)、缺氧/复氧模型组(H/R组)、H/R+CPG-ODN组、H/R+PD-L1组,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测各组细胞活性,乳酸脱氢酶(LDH)检测各组LDH活性,实时荧光定量聚合酶链反应检测各组中PD-L1、bcl-2、bax mRNA表达。采用单因素方差分析进行组间比较。结果I/RI后心脏组织中T细胞比例明显上升;Pdcd1基因[程序性死亡因子-1(PD-1)的靶基因]是I/RI后变异系数最大基因;CCK-8结果显示H/R+CPG-ODN组细胞存活率高于H/R和H/R+PD-L1组(73.88±3.40比55.24±2.17、45.89±1.99,F=988.50,P<0.01);LDH检测结果显示H/R组、H/R+CPG-ODN组、H/R+PD-L1组高于Control组(171.972±2.551、140.276±8.204、231.931±12.932比113.806±13.526,F=73.20,P<0.05);H/R+CPG-ODN组低于H/R组(140.276±8.204比171.972±2.551,t=7.88,P<0.01);H/R+PD-L1组高于H/R组(231.931±12.932比171.972±2.551,t=6.39,P<0.05);I/RI组IL-2、IL-6、IFN-γ高于假手术组(95.51±5.29、156.27±11.89、43.75±0.87比38.13±2.67、59.38±5.55、26.66±0.23,t=37.11、12.80、41.15,P<0.001);蛋白印迹法结果显示,CPG-ODN组PD-L1高于H/R组(3.06±0.38比1.79±0.11,t=5.66,P<0.05);CPG-ODN组bcl-2高于H/R组(0.95±0.09比0.66±0.02,t=5.18,P<0.05),PD-L1组bax高于H/R组(1.54±0.02比1.18±0.01,t=6.88,P<0.05);H/R+CPG-ODN组PD-L1相对表达量高于H/R组(4.39±0.45比2.15±0.28,t=7.32,P<0.05);H/R+CPG-ODN组bcl-2相对表达量高于H/R+PD-L1组(0.91±0.08比0.45±0.08,t=7.40,P<0.05);H/R+PD-L1组bax相对表达量高于H/R+CPG-ODN组(1.826±0.138比1.060±0.113,t=7.44,P<0.05)。结论通过激活PD-1/PD-L1信号通路发挥免疫调节作用,能够显著降低I/RI引起的炎性反应,从而发挥心肌保护作用。

Notch1受体在脑缺血损伤中表达变化及作用的体外研究

目的观察Notch1受体在脑缺血损伤中的表达变化及其配体Jagged1对缺血损伤的影响,探讨Notch信号通路可能参与脑缺血损伤的机制。方法建立PC12诱导的神经元样细胞氧糖剥夺(OGD)体外脑缺血模型,应用Real-time PCR及Western-blot技术,检测OGD 3h、6h、9h、12h、16h、24h Notch1表达变化;MTT法检测外源性配体Jagged1对细胞缺血损伤的影响。结果与对照组相比,OGD后不同时间Notch1 mRNA及蛋白的表达量均有显著升高,3h时达最高峰,其后随OGD时间的延长逐渐下降,OGD 24h达最低点(P<0.05)。分别与对照组比较,外源性Jagged1干预可使正常及缺血神经元存活率均下降(P<0.05)。结论 Notch信号转导通路可能通过内源性的Notch1受体表达上调参与脑缺血性损伤过程。