小檗碱通过Notch途径抑制人T淋巴细胞性白血病Molt-4细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨小檗碱对人T淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞体外增殖抑制、凋亡诱导及相关机制。方法CCK-8法检测不同浓度的小檗碱对Molt-4细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-PCR检测Molt-4细胞Notch1、Bcl-xl、Deltex1基因表达情况。结果小檗碱诱导Molt-4细胞毒性及凋亡作用,呈剂量依赖性(P<0.05);RT-PCR显示Molt-4细胞株有Notch1 mRNA的表达,且随着小檗碱剂量的增加,Notch1、Bcl-xl、Deltex1 mRNA的表达逐渐下降。结论小檗碱可能通过Notch信号途径抑制Molt-4细胞增殖并诱导凋亡。

细胞内活化的Notch途径报告基因质粒的构建和鉴定

目的构建并鉴定一种检测细胞内活化的Notch信号途径的报告基因质粒,用于研究该途径在宫颈癌细胞中的作用机制。方法构建报告基因质粒pTP1-EGFP-N1;测序及酶切鉴定后,与Notch的胞内段(NIC)共转染宫颈癌Hela细胞,观察其表达。结果构建了报告基因质粒pTP1-EGFP-N1,与NIC共转染Hela细胞后有阳性表达。结论该报告基因质粒的成功构建为进一步研究Notch信号途径在宫颈癌发生中的作用机制奠定了实验基础。

CYP2J2通过激活Notch1途径改善慢性间歇性低氧后心血管损伤的实验研究

目的:探讨细胞色素P450表氧化酶2J2(CYP2J2)对慢性间歇性低氧(CIH)模型大鼠心血管损伤的影响及机制。方法:将50只SD大鼠随机分为对照组、CYP2J2组、CIH组、CIH+CYP2J2组、CIH+CYP2J2+DAPT组,每组10只。CIH组、CIH+CYP2J2组及CIH+CYP2J2+DAPT组大鼠均构建CIH模型;造模成功后,CYP2J2组、CIH+CYP2J2组、CIH+CYP2J2+DAPT组大鼠一次性尾静脉注射携带CYP2J2基因的重组腺病毒;CIH+CYP2J2+DAPT组再通过腹腔注射DAPT。2周后,采用高分辨率小动物超声影像系统测定各组大鼠左室缩短分数(FS)、射血分数(EF)、左室收缩末期容积(LVESV)和左室舒张末期容积(LVEDV);自动生化分析仪检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)与心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量;硝酸还原酶法测定血清一氧化氮(NO)含量;酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆内皮素-1(ET-1)含量;苏木精-伊红(HE)染色观察主动脉及心肌组织形态学变化;末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记法(TUNEL)染色观察心肌细胞凋亡情况;生化指标检测试剂盒测定心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)活性与丙二醛(MDA)含量;蛋白免疫印迹法(Western Blot)测定心肌组织Notch受体1(Notch1)信号途径相关蛋白表达水平。结果:与CIH组比较,CIH+CYP2J2组大鼠FS和NO水平升高,LVESV、LVEDV及CK-MB、cTnI、ET-1水平均降低,主动脉结构基本清晰,细胞肿大、脱落及血管壁增厚等现象均有所改善,心肌纤维断裂、心肌细胞肿大等现象减轻,心肌组织TUNEL阳性细胞比例减少,SOD活性升高,MDA含量下降,Notch1和Hes1蛋白相对表达量上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与CIH+CYP2J2组比较,CIH+CYP2J2+DAPT组大鼠FS和NO水平降低,LVESV、LVEDV及CK-MB、cTnI、ET-1水平均升高,主动脉组织及心肌组织病理损伤现象显著,心肌组织TUNEL阳性细胞比例增加,SOD活性下降,MDA含量升高,Notch1和Hes1蛋白相对表达量下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:CYP2J2可改善CIH大鼠心血管损伤,减少心肌细胞凋亡,并抑制氧化应激水平,该机制可能与激活Notch1途径有关。

EEF1A1对急性心肌梗死模型大鼠心肌细胞凋亡及Notch/AKT转导途径的影响

目的:探讨人类真核翻译延长因子(EEF1A1)对急性心肌梗死(AMI)模型大鼠心肌细胞凋亡及Notch/蛋白激酶B(AKT)转导途径的影响。方法:将30只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、干预组,每组10只,模型组、干预组于冠状动脉左前降支结扎建立AMI大鼠模型,对照组仅手术穿线处理不结扎。建模后24 h干预组于心肌梗死区原位注射EEF1A1腺病毒,模型组、对照组注射等量生理盐水。干预72 h后,心脏彩超测定大鼠心功能,采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)染色法评估心肌细胞凋亡,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TCC)染色法评估心肌梗死面积,采用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定EEF1A1 mRNA表达量,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测心肌组织EEF1A1蛋白以及Notch/AKT信号通路相关蛋白表达情况。结果:干预前,模型组、干预组左室射血分数(LVEF)明显低于假手术组(P<0.05),而左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)明显高于假手术组(P<0.05);干预后3 d后,干预组LVEDD、LVESD明显降低,而LVEF明显增加,模型组LVEDD、LVESD明显增加,而LVEF明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。干预组心肌组织EEF1A1蛋白及mRNA表达水平高于假手术组、模型组(P<0.05),而模型组心肌组织EEF1A1蛋白及mRNA表达水平高于假手术组(P<0.05)。干预组心肌梗死面积小于模型组(P<0.05)。干预组心肌细胞凋亡率明显高于假手术组(P<0.05),明显低于模型组(P<0.05)。干预组Notch1、Hes1、磷酸化AKT(p-AKT)/AKT相关蛋白表达明显高于模型组、假手术组,模型组Notch1、Hes1、p-AKT/AKT相关蛋白表达均明显高于假手术组(P<0.05)。结论:EEF1A1可抑制AMI大鼠心肌细胞损伤、凋亡,缩小心肌梗死面积,改善心脏功能,其作用机制可能与上调Notch/AKT转导途径有关。

Notch信号途径效应分子HES1的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的 原核表达HES1分子 ,并制备其特异性多克隆抗体 ,以研究该分子在肿瘤细胞中的表达情况。方法 诱导表达GST HES1融合蛋白和GST ,经谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和纯化后 ,用GST偶联预激活的Sepharose 4B ,以GST HES1为免疫原制备兔抗血清。得到的抗血清经GST Sepharose 4B吸收抗GST成分 ,以间接ELISA和Westernblot鉴定抗体特异性 ,以Westernblot分析胃癌、结肠癌及其相应非癌变组织中HES1的表达水平。结果 成功地表达并纯化了GST HES1融合蛋白。制备的抗HES1多克隆抗体具有很高的特异性 ,与GST或大肠杆菌成分无交叉反应 ,用于进行天然HES1分子的Westernblot检测时效果良好。初步检测发现 ,胃癌和结肠癌中HES1的表达水平明显高于相应的正常组织。结论 通过原核表达并纯化HES1,成功地制备了该分子的特异性多克隆抗体 。

Notch信号途径在血管形成和内皮细胞中的作用

Notch信号途径除了可以直接调控免疫细胞的发生和功能外,还可以通过血管内皮细胞影响免疫应答。血管形成(angiogenesis)是成年个体血管生长最重要的方式,不仅参与组织的发育与再生,还参与多种疾病如肿瘤的发生和进展。血管形成最主要的调控信号是血管内皮生长因子及其受体组成的信号途径。近年来的研究表明,进化上高度保守的Notch信号途径也是血管形成的重要调控信号途径。Notch信号途径可参与血管形成中的多个步骤,如顶端细胞的分化、内皮细胞的增殖、成熟血管结构的形成等。此外,Notch信号途径还参与血管形成相关疾病的发生和进展。尤为引人注目的是,近来发现Notch信号途径是肿瘤新生血管的重要调控信号,提示深入揭示Notch信号在血管形成中的作用和机制极有可能为开发新生血管靶向治疗提供靶点。

Notch信号途径对放疗后骨髓谱系造血重建的影响及其机制

目的探讨Notch信号途径对放疗后骨髓谱系造血重建的影响及其机制。方法通过交配获得骨髓造血细胞特异性敲除Notch信号MxCre^+RBP-J^(flox/flox)的双转基因小鼠(敲除组)和未敲除MxCre^+RBP-J^(flox/+)对照小鼠(未敲除组),给予全身一次性^(60)Co-γ射线电离辐照,观察辐照后第7天两组生存状态、造血重建情况。C57/B6小鼠接受全身一次性^(60)Co-γ射线电离辐照,通过腹腔注射Notch配体重组蛋白D1R或PBS分别建立Notch信号激活小鼠(激活组)和未激活小鼠(未激活组),观察给药第7天重组蛋白D1R的体内活性、两组造血重建情况以及髓系前体细胞周期、增殖信号通路变化。另取C57/B6小鼠随机分为阴性对照组、D1R组、阳性对照组,D1R组和阳性对照组同时接受等剂量^(60)Co-γ射线电离辐照后腹腔注射D1R和PBS,阴性对照组不予处理,停药3个月,观察重组蛋白D1R长期毒性。结果与未敲除组比较,敲除组生存状态更差,骨髓造血干/祖细胞、骨髓和外周血有核细胞及髓系细胞形态正常,但数量明显减少(P均<0.05)。与未激活组比较,激活组骨髓造血细胞Notch信号活化片段ICN1的核表达增多,Notch信号激活,骨髓造血干/祖细胞、骨髓和外周血有核细胞及髓系细胞数均明显高于对照组(P均<0.05),骨髓髓系前体细胞G_0/G_1期比例减少,S期比例增多,PI3K蛋白表达增加(P均<0.01)。停药3个月,D1R组细胞形态、组织构架及造血谱系与阴性对照组无明显差别,但骨髓造血干/祖细胞、骨髓和外周血髓系细胞数明显高于阳性对照组(P均<0.05)。结论 Notch信号途径可正向调控放疗后造血重建,尤其髓系重塑,其机制可能与Notch信号激活髓系前体细胞PI3K增殖信号通路、加快细胞周期进程有关。

Notch1信号途径在皮肤鳞癌SCL-1细胞中的激活及其对细胞周期的影响

目的:研究Notch1及其下游靶基因Hes1在皮肤鳞状细胞癌(简称鳞癌)细胞株SCL-1细胞中的表达及上调Notch1表达对细胞周期的影响。方法:将Notch1真核表达载体通过脂质体2000转染SCL-1细胞,通过反转录(RT)-PCR和Westernblotting检测Notch1和Hes1基因在皮肤鳞癌SCL-1细胞中的表达,并利用CCK-8试剂分析上调Notch1表达对皮肤鳞癌SCL-1细胞增殖的影响,通过流式细胞仪观察Notch1过表达对细胞周期的影响。结果:SCL-1细胞中存在Notch1和Hes1基因表达,提示该信号途径在皮肤鳞癌细胞中处于激活状态,转染Notch1真核表达载体后,与未处理组和空载体组相比,转染组中Notch1和Hes1的mRNA和蛋白表达都明显增加(P<0.05)。此外,细胞增殖实验结果表明,过表达Notch1能明显抑制皮肤鳞癌SCL-1细胞增殖。流式细胞仪检测结果显示,Notch1过表达使细胞周期静止在G_0/G_1期。结论:Notch1过表达能引起皮肤鳞癌SCL-1细胞的细胞周期静止在G_0/G_1期,Notch1信号途径可能在皮肤鳞癌的进展中起作用。

Notch1信号途径在食管鳞癌细胞中的激活及对细胞周期的影响

目的观察Notch1信号途径在食管鳞癌EC9706细胞中的激活状态及其对细胞周期的影响。方法通过免疫细胞化学检测Notch1基因在食管鳞癌细胞株EC9706细胞中的表达,并通过免疫荧光方法研究Notch1基因在EC9706细胞中的激活状态。并且利用CCK-8试剂检测食管癌细胞的增殖状态。此外,采用RT-PCR和Western blot技术检测与细胞周期相关基因的表达,最后通过流式细胞仪进一步探索激活的Notch1信号途径对细胞周期的影响。结果转染pcNICD后的食管鳞癌细胞株中发现Notch1基因的表达。免疫荧光结果显示,转染pcNICD后的食管鳞癌细胞株中Notch1信号途径处于激活状态。与未处理和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比,稳定表达NICD的EC9706细胞的生长速率明显受到抑制(P<0.01)。此外,与未处理的和转染pcD-NA3.1的EC9706细胞相比,稳定表达NICD的EC9706细胞的CDK2,cyclin D1和E基因的mRNA和蛋白的表达明显下调(P<0.05)。转染pcNICD的EC9706细胞在G0/G1期的比率高达74.5%,而未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞在G0/G1期的比率分别为59.1%和59.0%。细胞周期分析显示瞬时表达NICD的EC9706细胞在G0/G1期比率的增加,提示激活的Notch1信号途径能够诱导细胞静止在G0/G1期。结论Notch1信号途径的激活引起食管鳞癌细胞的细胞周期静止,提示Notch1基因有可能成为治疗食管鳞癌的新靶点。

Notch信号途径在儿童结核病中的作用研究

目的研究Notch信号途径相关分子在儿童结核病中的表达情况,探讨其在儿童结核病发生中的作用。方法选取2017年6月至2018年12月确诊的结核病患儿62例为病例组,另选取健康儿童64例为健康对照组,采集外周静脉血2 mL,应用实时荧光定量PCR法检测白细胞中Notch信号途径相关分子(受体Notch1~4,配体Jagged1、2和DLL1、3、4,下游靶基因Hes1和Hey1)mRNA水平。结果与健康对照组相比,病例组患儿白细胞中Notch1、2和DLL4 mRNA水平均显著升高(P < 0.05);病例组患儿白细胞中其他信号分子Notch3、4,Jagged1、2,DLL1、3,Hes1和Hey1 mRNA水平与健康对照组相比,差异均无统计学意义(P > 0.05)。结论 Notch1、2和DLL4 mRNA水平在结核病患儿中表达明显升高,但下游靶基因表达无明显变化,提示儿童结核菌感染后Notch1、2与其配体DLL4相互作用启动Notch信号途径,可能通过作用于其他靶基因在儿童结核病中发挥作用,需进一步研究探讨。

肾细胞癌组织中Notch信号途径蛋白表达水平的检测及其意义

目的:检测人肾细胞癌(RCC)组织中Notch信号途径相关蛋白的表达水平,探讨Notch信号途径分子与人RCC发生发展的关系。方法:手术方法获得6例经病理检查诊断为RCC组织标本,采用Westernblotting法检测RCC组织和癌旁组织中Notch信号通路受体、配体蛋白表达水平。结果:与癌旁组织比较,RCC组织中Notch信号的受体Notch-1以及配体Jagged-1的表达水平均明显降低(P<0.05),受体Notch-2及配体Jagged-2表达水平均明显升高(P<0.05)。结论:RCC中Notch信号途径蛋白表达水平发生了明显的变化,Notch信号途径可能参与了RCC的发生发展过程。

Notch 1信号途径的激活及其对宫颈癌细胞凋亡的影响

目的探讨Notch1信号途径在宫颈癌细胞中的激活,并研究其对宫颈癌细胞凋亡的影响。方法扩增人胎盘组织细胞内的全长NICD,并构建pcDNA3.1-NICD真核表达载体。通过脂质体转染宫颈癌细胞,筛选稳定表达NICD的宫颈癌细胞株。通过RT-PCR及Western blotting检测Notch1和Hes1基因的表达,并通过流式细胞仪观察其对宫颈癌细胞凋亡的影响。结果未处理及转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-NICD的Hela细胞中均存在Notch1及Hes1基因的表达,表明该信号通路在Hela细胞中处于激活状态。然而,转染NICD的宫颈癌细胞株Notch1及Hes1的表达明显升高,提示该通路可能在外源NICD的影响下处于过度激活状态。流式细胞仪检测结果显示,在未处理和转染pcDNA3.1的Hela细胞中,细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);但与未处理的和转染pcDNA3.1的Hela细胞相比,稳定表达NICD的Hela细胞的细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论外源的NICD通过Notch1信号途径能引起宫颈癌细胞的凋亡,提示Notch1可能成为治疗宫颈癌的分子靶点。

Notch信号途径关键转录因子RBP-JK基因敲除结肠癌细胞株CT-26的体内外增殖能力观察

目的探讨Notch信号途径关键转录因子重组信号蛋白-JK(RBP-JK)基因敲除的结肠癌细胞株CT-26的体外增殖能力及体内成瘤能力,以探讨Notch信号途径在结肠癌发病机制中的作用。方法通过敲除RBP-JK靶序列的慢病毒干扰抑制小鼠结肠癌细胞株CT-26中Notch信号途径关键性转录因子RBP-JK的表达制作RBP-JK基因敲除CT-26细胞株模型,鉴定模型制作成功后,采用BrdU掺入实验,根据相同时间内掺入BrdU的细胞比例大小,观察RBP-JK基因敲除CT-26细胞株及对照CT-26细胞株的体外增殖能力;通过体内成瘤实验、根据肿瘤生长体积大小观察RBP-JK基因敲除CT-26细胞株及对照CT-26细胞株在小鼠体内的成瘤能力。结果RBP-JK基因敲除CT-26细胞株、对照CT-26细胞株在培养1 h时掺入BrdU的细胞比例分别为15.21%±0.242%、10.78%±0.251%,二者比较,t=31.10,P<0.01;在培养3 h时掺入BrdU的细胞比例分别为25.46%±0.316%、13.26%±0.284%,二者比较,t=70.26,P<0.01。RBP-JK基因敲除CT-26细胞株接种后第24、27、30天,小鼠直肠原位肿瘤体积分别为(0.351±0.014)、(0.422±0.011)、(0.737±0.021)mm 3,对照CT-26细胞株接种后第24、27、30天,小鼠直肠原位肿瘤体积分别为(0.513±0.013)、(1.161±0.114)、(1.848±0.016)mm 3,二者同时间比较,t分别为25.61、15.84、101.10,P均<0.01。结论RBP-JK基因可阻断结肠癌细胞株CT-26的Notch信号途径,敲除RBP-JK基因敲除CT-26细胞株体外增殖能力及体内成瘤能力均降低。

DLL4/Notch信号途径对A549细胞VEGF表达的影响

目的研究Delta-like ligand 4(DLL4)与血管内皮生长因子(VEGF)在人肺腺癌A549细胞中的表达,以及DLL4对VEGF表达的影响。方法 (1)用免疫组化检测DLL4与VEGF在A549细胞中的表达;(2)设计和化学合成靶向DLL4基因的小干扰RNA(siRNA)序列,用lipofectamineTM2000介导DLL4 siRNA转染人A549细胞;(3)提取细胞总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增检测DLL4、VEGF mRNA;(4)用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测A549细胞培养上清液中VEGF质量浓度。结果 (1)DLL4、VEGF表达于A549细胞的细胞质内;(2)DLL4 siRNA可使DLL4沉默,同时,明显上调VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C mRNA表达,差异有统计学意义(P<0.05);(3)DLL4转染后,细胞培养上清液中VEGF质量浓度明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论阻断A549细胞中Notch通路可刺激VEGF过表达。

Notch信号途径与哺乳动物的内耳感觉上皮发育

Notch途径作为动物发育中重要的信号转导途径,参与了胚胎发育中多种细胞系定向分化的调控。最近研究认为Notch信号传导途径参与哺乳动物内耳感觉前体细胞定向分化为毛细胞和支持细胞及嵌合体形成。本文就Notch信号途径在哺乳动物内耳感觉上皮发育中的研究进展进行综述。

Notch信号途径中的Su(H)和E(spl)基因对果蝇天然免疫的影响

天然免疫系统是多细胞生物抵抗各种入侵微生物的第一道防线.Notch途径介导相邻细胞之间的相互作用,调节细胞、组织、器官的分化和发育.为了进一步探索Notch信号途径在果蝇天然免疫中的功能,利用Notch途径下游基因Su(H)和E(spl)的低表达突变体果蝇,通过体外注射病原体分析了生存率、血细胞的噬菌功能和抗菌肽的表达量以及突变体的血细胞数量.结果表明,革兰氏阴性细菌和真菌感染后果蝇E(spl)突变体的生存率、噬菌能力及抗菌肽的表达量明显降低,而且幼虫期血细胞出现异常增殖;Su(H)突变体只对真菌表现出敏感性,抗菌肽的表达量降低,但是对真菌的噬菌能力正常.此结果表明,Notch途径不仅影响个体的生长发育,而且在果蝇天然免疫中也起重要的调节作用.

人气道上皮Notch途径下调与吸烟及COPD相关

气道上皮是吸烟损伤的主要目标。多种损伤机制作用会调节上皮的再生，引起分化异常。多个信号传导途径，包括Notch途径，对肺形成过程中的上皮分化进行调节。但这些调节途径在成人中的机制尚不清楚。纽约科内尔大学Weill医学院的TilleyAE等提出假说：Notch相关基因在非吸烟成人的小气道上皮中有表达，在健康吸烟者及患慢性阻塞性肺疾病（COPD）的吸烟者中，存在Notch相关基因表达的下调，并对此进行了研究，

Notch信号途径的调节

Notch信号途径是通过局部细胞间相互作用,实现细胞间通讯、胞浆内的信号转导以及核内转录,从而控制细胞的增殖、分化、凋亡、迁移及粘附等细胞的命运的途径。它在进化中非常保守,在机体的整个生长发育过程的调控中发挥着重要的作用。Notch信号途径作用过程受其他多种分子和途径的调节。本文从细胞外水平、细胞浆水平和细胞核水平分别讨论了Notch信号途径的调节。对进一步了解Notch信号途径,解释生理病理现象、控制和治疗疾病提供基础。

Notch信号途径对过敏性鼻炎小鼠Treg/Th17细胞免疫失衡调节的机制

目的:探究Notch信号途径对过敏性鼻炎小鼠调节性T细胞/辅助性T细胞17(Treg/Th17)细胞免疫失衡的调节机制。方法:30只BALB/c小鼠均分为对照组、模型组及Notch信号途径抑制剂分泌酶抑制剂(γ-DAPT)组,模型组和γ-DAPT组于第1、7、14及第21~27天采用卵清蛋白(OVA)+氢氧化铝[AL(OH)3]滴鼻诱导过敏性鼻炎,γ-DAPT组在刺激前30 min鼻内滴注20μLγ-DAPT(10μg);末次局部刺激后,流式细胞仪检测各组小鼠鼻黏膜组织Treg及Th17细胞比例,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清白细胞介素(IL-10、IL-17)和转化生长因子β(TGF-β)水平,实时荧光定量PCR和蛋白印迹(Western blot)法检测鼻黏膜组织中Notch1、配体分子Jagged1及下游产物Hes1的表达。结果:与对照组比较,模型组小鼠行为学评分、Th17细胞比例及血清IL-17水平明显升高,鼻黏膜组织Notch1、Jagged1及下游Hes1 mRNA及蛋白表达上调,Treg细胞比例及血清IL-10、TGF-β水平降低(P<0.05);与模型组比较,γ-DAPT组行为学评分、Th17细胞比例及血清IL-17水平明显降低,鼻黏膜组织Notch1、Jagged1及下游Hes1 mRNA及蛋白表达下调,Treg细胞比例及血清IL-10、TGF-β水平升高(P<0.05)。结论:Notch信号途径可能参与过敏性鼻炎的致病机制,其抑制剂γ-DAPT可纠正Treg/Th17细胞免疫失衡,从而减轻过敏性鼻炎症状。