白血病细胞中共表达P2X7受体和Notch1胞内区

本研究旨在构建野生型及N187D突变型P2X7与ICN1基因的共表达载体,并在白血病细胞中表达,为进一步探讨P2X7在白血病发展中的作用奠定基础。采用Overlap PCR法,通过2A连接,构建野生型或N187DP2X7与ICN1的共表达载体;经DNA序列分析验证后,包装病毒、感染K562细胞并经细胞分选获得稳定感染细胞系。采用RT-PCR、Western blot、胞浆游离钙离子浓度测定等方法,验证外源基因的表达及P2X7受体的功能。结果表明,序列分析显示载体构建正确;包装病毒对K562细胞感染效率40%-70%,流式分选获得稳定表达细胞株;RT-PCR结果显示,P2X7受体和/或ICN1基因可在对应的稳定表达细胞株中高效表达;Western blot也证明,P2X7受体可在感染编码P2X7受体基因病毒的K562细胞中高效表达;胞浆游离钙离子浓度检测显示,在BzATP刺激下,表达野生及N187D突变型P2X7的K562细胞胞浆游离钙离子浓度持续升高。结论:本研究在白血病细胞中成功共同高表达P2X7受体与ICN1,为进一步探讨野生型和N187D突变型P2X7受体在白血病发展中的作用奠定基础。

重组腺病毒过表达Notch1受体胞内结合域(NICD1)外源性激活Notch信号通路

目的:构建Notch1受体胞内结合域(Notch1 intracellular domain,NICD1)的重组腺病毒AdNICD1,探讨外源性过表达AdNICD1对Notch信号通路激活的影响。方法:利用高保真PCR(high fidelity PCR,Hi-Fi PCR)扩增NICD1编码区,并通过Gibson Assembly方法将其克隆至腺病毒载体中,经过菌落PCR、测序鉴定后,在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,再次通过质粒PCR鉴定,然后运用PacⅠ酶切线性化后用重组腺病毒载体转染过表达pTP基因的人胚肾293细胞(human embryo kidney 293 cell line,HEK293)中进行包装,收取病毒后使用过表达pTP基因的HEK293细胞扩增重组腺病毒AdNICD1。运用AdNICD1感染脂肪来源的间充质干细胞(immortalized multipotent adipose-derived mesenchymal stem cells,iMAD),检测病毒感染效率;通过Q-PCR检测NICD1和Notch下游基因表达情况;利用Westernblot检测NICD1在蛋白水平的表达情况。结果:成功构建过表达NICD1的重组腺病毒并有效感染iMAD;利用AdNICD1可明显增加NICD1在基因和蛋白水平的表达,并激活Notch信号下游基因的表达。结论:成功构建过表达NICD1的重组腺病毒,并有效激活Notch信号通路。