有氧运动训练影响阿尔茨海默症小鼠海马Notch1、Caspase-3的表达

背景:β-淀粉样蛋白和Tau蛋白会对阿尔茨海默症患者的认知功能产生不良影响,研究发现Notch1及Caspase-3能够调控β-淀粉样蛋白和Tau蛋白的表达。Notch1及Caspase-3是否介导了有氧运动改善阿尔茨海默症患者认知能力的过程还不清楚,目前缺乏长期有氧运动影响阿尔茨海默症小鼠海马中Notch1及Caspase-3表达的研究。目的:观察长期有氧运动干预阿尔茨海默症小鼠的空间学习记忆情况及其海马中Notch1及Caspase-3的表达,探讨Notch1及Caspase-3对阿尔茨海默症小鼠的影响。方法:将3月龄野生型及APP/PS1双转基因阿尔茨海默症小鼠随机分为4组:野生对照组、野生运动组、阿尔茨海默症对照组、阿尔茨海默症运动组,每组20只。对照组小鼠不进行运动,运动组小鼠进行5个月的有氧运动干预。运动干预结束后,采用Morris水迷宫检测小鼠空间学习记忆能力;采用Real-timePCR、免疫荧光及Westernblot检测各组小鼠海马组织Aβ_(1-42)、Tau、Notch1及Caspase-3蛋白的表达。结果与结论:①阿尔茨海默症小鼠空间学习记忆能力显著差于野生组(P<0.05);运动组小鼠空间学习记忆能力显著优于对照组(P<0.05);②阿尔茨海默症对照组小鼠海马Aβ_(1-42)、Tau、Notch1及Caspase-3表达均显著高于野生对照组(P<0.05);阿尔茨海默症运动组小鼠海马Aβ_(1-42)、Tau、Notch1及Caspase-3表达显著低于阿尔茨海默症对照组(P<0.05);③提示:长期有氧运动干预能够改善阿尔茨海默症小鼠的空间学习记忆能力,而这可能与有氧运动降低阿尔茨海默症小鼠海马Notch1、Caspase-3、Aβ_(1-42)及Tau蛋白表达有关。

牛蒡子苷元调控Notch/Hes-1信号通路对口腔鳞状细胞癌HSC-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

目的:探究牛蒡子苷元(ARC)通过调控Notch/Hes-1信号通路对口腔鳞状细胞癌(OSCC)HSC-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及其机制。方法:使用不同质量浓度的ARC处理人HSC-3细胞,CCK-8法检测ARC对细胞增殖活力的影响,以选择适宜的药物浓度。将HSC-3细胞分为对照组、ARC-L组(10 mg/L ARC)、ARC-M组(20 mg/L ARC)、ARC-H组(40 mg/L ARC)和ARC-H+Jagged1/FC组(40 mg/L ARC+1.2μg/mL Jagged1/FC)。采用EdU法检测细胞增殖能力,划痕愈合实验、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞的迁移、侵袭能力及细胞周期和细胞凋亡率,WB法检测增殖(c-Myc、cyclin D1)、凋亡(BAX、Bcl-2、survivin)、EMT(E-cadherin、vimentin、Snail)及Notch/Hes-1通路(Notch 1、Hes-1、NICD)相关蛋白的表达水平。结果:与0 mg/L相比,10~80 mg/L的ARC均能显著降低HSC-3细胞增殖活力(均P<0.05)。与对照组相比,ARC-L组、ARC-M组和ARC-H组HSC-3细胞EdU阳性率、划痕愈合率、侵袭细胞数、S期和G2/M期细胞占比及c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、survivin、vimentin、Snail、Notch 1、Hes-1和NICD蛋白表达均显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率、G0/G1期细胞占比及BAX、E-cadherin的蛋白表达均显著升高(均P<0.05),且呈浓度梯度依赖性。同时使用Notch激动剂Jagged1/FC,则可部分逆转ARC对HSC-3细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及相关蛋白表达的作用(均P<0.05)。结论:ARC可能通过抑制Notch/Hes-1信号通路抑制OSCC细胞HSC-3增殖和侵袭并促进细胞凋亡。

Periostin、Notch1、维生素D与自身免疫性甲状腺炎淋巴细胞浸润程度、Treg/Th17的相关性研究

目的探讨骨外膜素(Periostin)、Notch跨膜受体-1(Notch1)m RNA、维生素D(VitD)与自身免疫性甲状腺炎(AIT)淋巴细胞浸润程度、调节性T细胞/辅助性T细胞17(Treg/Th17)的相关性。方法选取2021年7月至2023年12月郑州大学第一附属医院收治的92例AIT患者纳入AIT组,另选取同期50例无甲状腺疾病的健康人群纳入对照组。比较两组受检者的淋巴细胞浸润程度及抗体水平,采用Spearman、Pearson相关系数分析淋巴细胞浸润程度、Treg/Th17与甲状腺功能、抗体水平的相关性,比较两组受检者的Periostin、Notch1 m RNA、VitD及Treg/Th17,采用Pearson相关系数分析Periostin、Notch1 mRNA、VitD与淋巴细胞浸润程度及Treg/Th17的相关性。结果AIT组患者的CD3^(+)、CD3^(+)CD4^(+)、CD4^(+)CD25^(+)CD127^(-)、TgAb、TPOAb、TRAb水平及甲亢/亚临床甲亢、甲减/亚临床甲减患者占比明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);Pearson相关系数分析结果显示,CD3^(+)(r=0.579、0.602、0.563)、CD3^(+)CD4^(+)(r=0.612、0.637、0.606)、CD~4+CD25^(+)CD127^(-)(r=0.655、0.643、0.687)与TgAb、TPOAb、TRAb呈正相关(P<0.05);AIT组患者的Periostin、Notch1 m RNA分别为(4.27±1.40)μg/L、1.73±0.56,明显高于对照组的(2.86±0.49)μg/L、1.02±0.14,VitD、Treg/Th17分别为(17.82±5.09)ng/mL、2.82±0.97,明显低于对照组的(22.30±3.76)ng/mL、12.36±2.03,差异均有统计学意义(P<0.05);Pearson相关系数分析结果显示,Periostin(r=0.792、0.811、0.737)、Notch1 mRNA(r=0.812、0.775、0.792)与CD3^(+)、CD3^(+)CD4^(+)、CD4^(+)CD25+CD127-呈正相关(P<0.05),VitD(r=-0.687、-0.753、-0.799)与之呈负相关(P<0.05),且Periostin(r=-0.823)、Notch1 m RNA(r=-0.772)与Treg/Th17呈负相关(P<0.05),VitD(r=0.745)与之呈正相关(P<0.05)。结论Periostin、Notch1 mRNA在AIT患者血清中表达上调,VitD表达下调,各指标与AIT淋巴细胞浸润程度及Treg/Th17均具有一定相关性,可为临床判断病情提供参考,并对后续临床治疗具有一定指导价值。

Notch1 mRNA和Dickkopf-1在评估非小细胞肺癌患者帕博利珠单抗治疗反应性中的价值

目的探讨Notch1 mRNA和Dickkopf-1在评估非小细胞肺癌(NSCLC)患者帕博利珠单抗治疗反应性中的价值。方法选取2020年7月—2022年9月邯郸市中心医院NSCLC患者169例(NSCLC组)、良性肺结节患者168例(对照组)。收集所有患者的临床资料,检测NSCLC组治疗前和帕博利珠单抗治疗3周、6周,对照组入组时的血清Notch1 mRNA相对表达量和Dickkopf-1水平。评估NSCLC患者帕博利珠单抗治疗6周后的治疗反应性[疾病进展(PD)、疾病控制(DC)]。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价治疗前Notch1 mRNA、Dickkopf-1判断帕博利珠单抗治疗反应性的效能。采用Logistic回归模型分析帕博利珠单抗治疗反应性的影响因素。结果NSCLC组治疗前、治疗3周和治疗6周的血清Notch1 mRNA相对表达量和Dickkopf-1水平均高于对照组(P<0.001)。NSCLC组治疗前、治疗3周和治疗6周的血清Notch1 mRNA相对表达量和Dickkopf-1水平依次降低(P<0.001)。PD组与DC组之间年龄、美国东部肿瘤协作组(ECOG)评分、临床分期、淋巴转移、远隔转移、分化程度、程序性死亡受体配体1(PD-L1)表达和治疗前、治疗3周、治疗6周血清Notch1 mRNA相对表达量、Dickkopf-1水平差异均有统计学意义(P<0.05)。血清Notch1 mRNA和Dickkopf-1单项检测和联合检测评估帕博利珠单抗治疗反应性的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.791、0.796、0.861。调整混杂因素后,治疗前高Notch1 mRNA组、高Dickkopf-1组PD风险分别是低Notch1 mRNA组、低Dickkopf-1组的3.517倍、3.326倍[比值比(OR)值分别为3.517、3.326,95%可信区间(CI)分别为2.159~5.728、2.211~5.003]。结论血清Notch1 mRNA表达和Dickkopf-1水平与帕博利珠单抗治疗反应性有关,可作为评估治疗反应性的有效指标。

乳岩宁对三阴乳腺癌荷瘤裸鼠Notch1信号通路的作用机制

目的 观察乳岩宁方与卡培他滨联用对MDA-MB-231乳腺癌荷瘤裸鼠的瘤组织中Notch1信号通路的作用。方法 用对数生长期的MDA-MB-231细胞悬液,于裸鼠左侧胸壁接种,成功长出瘤组织后将其移植到未接种裸鼠的胸壁,建立三阴乳腺癌模型,共40只荷瘤裸鼠,分5组,每组8只,日1次灌胃,连续21 d灌药。观察裸鼠状态并计算肿瘤组织的抑制率;免疫印迹法测定Notch 1、Notch1受体的细胞内结构(Notch1 intracellular domain, NICD1)、与YRPW基序相关的发状分裂增强子1(Hairy and enhancer of split related with YRPW motif 1,Hey1)、发状分裂相关增强子1(Hairy and enhancer of split Homolog 1,Hes1)、髓细胞增生原癌基因(Cellular myelocytomatosis oncogene, C-myc)的蛋白表达量;实时荧光定量PCR测定Notch 1、Hey1、Hes1、C-myc的基因表达量。结果 与模型组对比,中药、西药和中药+西药组的肿瘤质量均有明显减轻,差异有统计学意义(P<0.01),3组的抑瘤率分别为33.11%、59.60%、65.93%。免疫印迹法结果表明,与模型组相比,中药组、西药组、中药+西药组的Notch 1、NICD1、Hey1、Hes1、C-myc蛋白水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);而Notch 1和Hes1的蛋白表达水平在中药组和西药组中水平相当,差异无统计学意义(P>0.05);中药+西药组较西药组中Hes1蛋白表达水平明显减低,差异有统计学意义(P<0.05)。实时荧光定量结果表明,与模型组相比,中药组、西药组、中药+西药组Notch 1、Hey1、Hes1、C-myc的mRNA水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);与西药组相比,中药组与西药组Notch 1、Hes1、C-myc的mRNA水平相当,差异无统计学意义(P>0.05);中药+西药组较西药组中Notch 1及Hey1的mRNA水平明显减低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 疏肝理气中药复方乳岩宁能够抑制三阴乳腺癌荷瘤裸鼠的肿瘤生长,其作用机制与三阴乳腺癌中的Notch1信号通路受到抑制相关。为疏肝理气中药治疗三阴乳腺癌,尤其是影响乳腺癌Notch1信号通路方面提供了实验依据。

miR-139-5p靶向Notch1抑制肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的探究miR-139-5p在肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)进展中的作用和调控机制。方法实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹检测LUAD组织和细胞中miR-139-5p和Notch同源物1(Notch1)的表达。经细胞转染后,qRT-PCR和蛋白质印迹验证转染效率。CCK-8、细胞划痕和Transwell实验用于检测LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭。双荧光素酶报告基因分析miR-139-5p与Notch1的靶向关系。蛋白质印迹检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达。结果与正常组织和人正常支气管上皮细胞相比,miR-139-5p在LUAD组织和细胞中显著下调(P<0.01),Notch1显著上调(P<0.01)。与对照组相比,过表达miR-139-5p明显抑制LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭,并下调p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表达(P<0.01)。Notch1被确定为miR-139-5p的直接靶标。过表达Notch1减弱了miR-139-5p过表达对LUAD细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用(P<0.05)。与对照组比较,miR-139-5p在体内显著抑制了异形移植瘤的生长(P<0.05)。结论miR-139-5p通过靶向Notch1并失活PI3K/Akt/mTOR途径抑制LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭。

miR-139-5p调控Notch/RBP-J/Hes1轴促进支气管哮喘骨髓间充质干细胞“归巢”

目的通过将哮喘支气管上皮细胞与骨髓间充质干细胞共培养方式,观察miR-139-5p调控Notch1信号通路对哮喘骨髓间充质干细胞归巢的影响。方法将大鼠骨髓间充质干细胞和支气管上皮细胞共培养,并予miR-139-5p mimics进行干预。实验分为阴性对照组(NC组:正常大鼠骨髓间充质干细胞+支气管上皮细胞共培养)、模型对照组(MC组:正常大鼠骨髓间充质干细胞+哮喘大鼠支气管上皮细胞共培养)、miR-139-5p mimics组(miR-139-5p mimics+MC)、miR-139-5p mimics-NC组(miR-139-5p mimics-NC+MC)。检测细胞活力和细胞周期变化;免疫荧光染色检测CXCR4、SDF-1表达;经细胞转染后观察miR-139-5p表达量和BMSCs归巢水平;免疫印迹观察Notch1/RBP-J/Hes1蛋白表达量;ELISA检测Th1、Th2相关因子表达情况。结果与NC组比较,MC组miR-139-5p、IL-2、IL-12表达量降低(P<0.05),BMSCs归巢水平增加,CXCR4、SDF-1、IL-5、IL-9表达升高(P<0.05),Notch1、RBP-J、Hes1 mRNA、蛋白表达升高(P<0.05)。与MC组、miR-139-5p mimics-NC组比较,miR-139-5p mimics组miR-139-5p、BMSCs归巢水平升高,CXCR4、SDF-1、IL-2表达升高(P<0.05),Notch1、RBP-J、Hes1mRNA、蛋白表达降低,IL-5、IL-9表达降低(P<0.05)。相关性分析显示,BMSCs归巢水平与miR-139-5p、IL-12呈正相关,SDF-1与miR-139-5p呈正相关(P<0.05);与IL-5表达呈负相关,CXCR4与Activated Notch1表达呈负相关,SDF-1与Notch1表达呈负相关(P<0.05)。结论miR-139-5p可能通过靶向Notch1信号通路促进哮喘骨髓间充质干细胞归巢,作用于Th1、Th2细胞因子表达,改善哮喘气道炎症。

EEF1A1对急性心肌梗死模型大鼠心肌细胞凋亡及Notch/AKT转导途径的影响

目的:探讨人类真核翻译延长因子(EEF1A1)对急性心肌梗死(AMI)模型大鼠心肌细胞凋亡及Notch/蛋白激酶B(AKT)转导途径的影响。方法:将30只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、干预组,每组10只,模型组、干预组于冠状动脉左前降支结扎建立AMI大鼠模型,对照组仅手术穿线处理不结扎。建模后24 h干预组于心肌梗死区原位注射EEF1A1腺病毒,模型组、对照组注射等量生理盐水。干预72 h后,心脏彩超测定大鼠心功能,采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)染色法评估心肌细胞凋亡,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TCC)染色法评估心肌梗死面积,采用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定EEF1A1 mRNA表达量,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测心肌组织EEF1A1蛋白以及Notch/AKT信号通路相关蛋白表达情况。结果:干预前,模型组、干预组左室射血分数(LVEF)明显低于假手术组(P<0.05),而左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)明显高于假手术组(P<0.05);干预后3 d后,干预组LVEDD、LVESD明显降低,而LVEF明显增加,模型组LVEDD、LVESD明显增加,而LVEF明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。干预组心肌组织EEF1A1蛋白及mRNA表达水平高于假手术组、模型组(P<0.05),而模型组心肌组织EEF1A1蛋白及mRNA表达水平高于假手术组(P<0.05)。干预组心肌梗死面积小于模型组(P<0.05)。干预组心肌细胞凋亡率明显高于假手术组(P<0.05),明显低于模型组(P<0.05)。干预组Notch1、Hes1、磷酸化AKT(p-AKT)/AKT相关蛋白表达明显高于模型组、假手术组,模型组Notch1、Hes1、p-AKT/AKT相关蛋白表达均明显高于假手术组(P<0.05)。结论:EEF1A1可抑制AMI大鼠心肌细胞损伤、凋亡,缩小心肌梗死面积,改善心脏功能,其作用机制可能与上调Notch/AKT转导途径有关。

Notch1介导有氧运动促进阿尔茨海默病小鼠海马神经细胞的增殖

背景:阿尔茨海默病患者脑部多存在Notch1信号通路异常,但这些信号通路在阿尔茨海默病发病中的作用尚未完全明确。长期有氧运动对于Notch1信号通路的相关因子甲基化率能够产生影响,从而改变Notch1的表达。然而,有氧运动是否会通过Notch1信号通路对阿尔茨海默病小鼠海马神经细胞增殖及组织病理学特征产生影响并不清楚。目的:观察DAPT抑制Notch1信号通路后有氧运动对阿尔茨海默病小鼠海马神经细胞增殖及组织病理学特征的影响。方法:随机将3月龄APP/PS1双转基因阿尔茨海默病小鼠分成4组,分别为对照组、运动对照组、抑制剂组及运动抑制剂组,每组20只。采用自然喂养干预对照组,长期有氧运动干预运动组,各干预方式的周期为20周;然后在第18周对各组小鼠进行溶剂或Notch1抑制剂注射。20周后取脑组织,采用Real-time PCR、免疫荧光及Western blot技术分别检测Aβ1-42、Tau、Ki67及Notch1表达。结果与结论:与对照组小鼠相比,抑制剂组小鼠海马齿状回区Ki67、Notch1的表达显著降低(P<0.05),Aβ1-42、Tau没有显著差异;运动对照组小鼠海马齿状回区Ki67表达显著高于对照组,而Aβ1-42、Tau、Notch1表达显著低于对照组(P<0.05);运动抑制剂组小鼠海马齿状回区Aβ1-42、Tau、Ki67、Notch1表达与抑制剂组相比没有显著差异。由此可见,Notch1信号通路可能介导运动改善阿尔茨海默病小鼠海马神经细胞增殖及组织病理学特征的过程。

免疫组化MYB和Notch1在乳腺腺样囊性癌中的应用

目的 探讨MYB、Notch1免疫组化染色在经典型乳腺腺样囊性癌(classic adenoid cystic carcinoma of the breast, C-AdCC)、具有基底细胞样特征的实体型乳腺腺样囊性癌(solid-basaloid adenoid cystic carcinoma of the breast, SB-AdCC)鉴别诊断中的应用价值。方法 收集病理科存档的20例C-AdCC、6例SB-AdCC及65例其他乳腺病变组织,分别行MYB、Notch1免疫组化染色,并对26例AdCC行FISH检测,6例SB-AdCC行NGS检测。结果 (1)MYB免疫组化染色显示:C-AdCC(20/20)弥漫中等或强阳性,SB-AdCC(4/6)弥漫中等或强阳性;胶原小体病(5/5)局灶或弥漫弱阳性;恶性腺肌上皮瘤(3/3)局灶中等或强阳性;8例产基质的癌、9例分泌性癌及40例非特殊型三阴型乳腺癌均阴性。(2)Notch1免疫组化显示:SB-AdCC(3/6)弥漫中等阳性,C-AdCC(20/20)均阴性;3例恶性腺肌上皮瘤、5例胶原小体病、8例产基质的癌、9例分泌性癌及40例非特殊型三阴型乳腺癌均阴性。(3)FISH检测显示C-AdCC(12/19)MYB基因断裂,NGS检测显示SB-AdCC(3/6)Notch1突变。结论 免疫组化MYB、Notch1中等或强的弥漫性表达,可辅助鉴别C-AdCC、SB-AdCC的分型;与恶性腺肌上皮瘤鉴别困难时,可借助分子检测进一步明确。

斑马鱼notch1a和notch1b对hsp70基因的调控作用

研究旨在通过双荧光素酶报告基因实验探究斑马鱼notch1a和notch1b基因对hsp70的调控作用。通过NCBI数据库检索获取了斑马鱼notch1a和notch1b基因的CDS序列,对其胞内段(Notch1a/Notch1b intracellular domain,N1aICD/N1bICD)进行克隆并构建pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体,在人胚肾细胞(HEK293T)中用Western Blot和亚细胞定位检测N1aICD和N1bICD的表达。通过生信分析并克隆斑马鱼hsp70启动子序列,构建pGL3-hsp70-pro报告基因,并在HEK293T中检测该报告基因的双荧光素酶活性。之后在HEK293T细胞中过表达notch1a和notch1b基因,通过双荧光素酶报告基因实验检测pGL3-hsp70-pro的活性变化,以此探究notch1a和notch1b对hsp70基因的调控作用。实验结果显示真核表达载体pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD构建成功,Western Blot显示pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD可正常表达,亚细胞定位显示N1aICD和N1bICD蛋白表达在HEK293T的细胞核中;双荧光素酶实验显示pGL3-hsp70-pro报告基因在HEK293T细胞中具有活性,是阴性对照质粒的3.7倍;在HEK293T细胞中pCMV-N1aICD和pCMV-N1bICD真核表达载体能够显著增强pGL3-hsp70-pro的活性,分别为对照组的4.9倍和5.1倍。实验结果表明斑马鱼notch1a和notch1b基因可显著增强hsp70基因的表达,为进一步研究Notch分子通过Hsp70进行抗感染免疫的分子机制提供了实验材料并奠定了理论基础。

田蓟苷对大鼠A7R5血管平滑肌细胞增殖、迁移、表型转化及Notch1信号通路调控的影响

目的 研究田蓟苷对A7R5血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化的影响及其抗动脉粥样硬化(AS)的可能作用机制。方法 采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激A7R5细胞建立血管平滑肌表型转化模型,将细胞分为正常组、模型组、田蓟苷组、Notch1通路抑制剂组(DAPT组)和辛伐他汀组。采用CCK8法检测细胞增殖情况,Transwell实验检测细胞迁移情况,实时荧光定量PCR法检测细胞SM22α、α-SMA、Notch1、Hes1、Hes5、Jagged-1 mRNA表达,Western blot法检测细胞Notch1、RBP-Jκ、Hes1蛋白表达。结果 与模型组比较,各给药组均可抑制A7R5细胞的异常增殖和迁移(P<0.05,P<0.01),上调α-SMA mRNA表达(P<0.01);田蓟苷组和DAPT组下调Notch1通路相关基因Notch1、Hes-1、Hes-5和Jagged-1 mRNA表达(P<0.05,P<0.01);田蓟苷组下调Notch1、Hes-1、RBP-Jκ蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论 田蓟苷通过抑制VSMCs的异常增殖、迁移、表型转化及调控Notch1信号通路,从而保护ox-LDL诱导的A7R5细胞损伤。

白藜芦醇抑制Notch1信号通路对抗小鼠急性T淋巴细胞白血病

目的:观察白藜芦醇(Res)对急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)小鼠的影响,并进一步探讨其对Notch1信号通路的作用机制。方法:将25只6-8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、T-ALL组和Res组,其中Res组又进一步分为low-Res(L-Res)、middle-Res(M-Res)和high-Res(H-Res)3个浓度给药组。应用流式细胞术和瑞氏-吉姆萨染色法检测外周血及脾细胞悬液中白血病细胞百分比,HE染色法观察脾脏和骨髓组织病理形态,RT-q PCR法检测脾脏组织中Notch1、Hes-1、c-Myc、mi R-19b和PTEN m RNA表达水平,Western blot法检测Notch1、Hes-1、c-Myc、p-PTEN和PTEN蛋白表达水平。结果:与对照组相比,T-ALL组小鼠外周血中白血病细胞明显增多,脾脏及骨髓组织中白血病细胞弥漫性浸润,脾脏中Notch1、Hes-1、c-Myc、mi R-19b m RNA表达水平和Notch1、Hes-1、c-Myc蛋白表达水平均明显增高(P<0.01),PTEN m RNA及其蛋白水平显著降低(P<0.01),经白藜芦醇处理后,H-Res组以上各项指标较T-ALL组均获得逆转。结论:白藜芦醇具有抗小鼠T-ALL的作用,其机制可能通过抑制Notch1信号通路发挥作用。

蓝莓花青素调控Notch1/Hes-1通路对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞氧化损伤的影响及机制研究

目的探讨蓝莓花青素(BA)对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞(RGC)氧化损伤的影响及可能的作用机制。方法将50只雄性SD大鼠随机分为正常组(NC组,n=10)和造模组,造模组一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)50 mg/kg,构建糖尿病模型,造模成功后再随机分为糖尿病模型组(DM组)、蓝莓花青素组(BA组)、DAPT组(Notch1通路抑制剂)和蓝莓花青素+DAPT组(BA+DAPT组),每组10只。BA组每天给予20 mg/kg的BA灌胃,DAPT组给予10μmol/L的DAPT干预,BA+DAPT组给予20 mg/kg的BA灌胃+10μmol/L的DAPT干预,NC组和DM组用等量0.9%氯化钠溶液(生理盐水)灌胃,连续8周。于末次给药24 h后,摘取大鼠眼球,用酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒检测各组大鼠视网膜组织中活性氧(ROS)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量;苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠视网膜组织病理变化,并进行RGC计数;用荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测量HO-1和iNOS mRNA表达;Western blot法检测Notch1和Hes-1蛋白的表达。结果建模后,DM组、BA组、DAPT组和BA+DAPT组空腹血糖(FBG)值均大于16.7 mmol/L;经BA干预治疗后,BA组和BA+DAPT组FBG含量明显降低,BA组低于BA+DAPT组(P<0.05)。ELISA结果表明,与NC组比较,DM组视网膜组织中ROS和MDA含量升高,CAT和SOD含量降低(P<0.05);与DM组比较,BA组和BA+DAPT组视网膜组织中ROS和MDA水平下降,CAT和SOD水平显著上升(P<0.05)。光学显微镜观察显示,NC组视网膜结构清晰,细胞形态正常,排列整齐;DM组大鼠RGC层排列紊乱,内、外核层伴随有水肿,出现了空泡现象,视网膜厚度变薄;BA组大鼠视网膜层结构排列较整齐,水肿程度和视网膜厚度较DM组有一定的改善;BA+DAPT组大鼠视网膜组织较DM组有所改善,但视网膜厚度相比BA组还是较薄。RGC计数结果显示,DM组、BA组、DAPT组和BA+DAPT组RGC数量分别为7.35±1.28、12.05±1.52、5.61±1.72、8.72±1.19,明显低于NC组的16.63±1.54,组间差异有统计学意义(F=88.905,P<0.05)。qRT-PCR结果表明,NC组、DM组、BA组、DAPT组和BA+DAPT组大鼠视网膜组织中HO-1水平分别为1.28±0.32、0.68±0.15、1.03±0.19、0.50±0.13和0.73±0.11,iNOS水平分别为0.48±0.08、1.17±0.21、0.89±0.17、1.35±0.15和1.10±0.23,差异均有统计学意义(F=25.192、35.843,P<0.05)。Western blot结果显示,与NC组相比,DM组视网膜组织中Notch1和Hes-1蛋白表达均下调;与DM组比较,BA组Notch1和Hes-1蛋白表达水平均上调,DAPT组Notch1和Hes-1蛋白表达水平均下调,BA+DAPT组两蛋白表达低于BA组,组间差异有统计学意义(F=47.626、54.709,P<0.05)。结论BA可以降低糖尿病大鼠FBG,增强其抗氧化应激能力,改善视网膜组织病理学损伤,从而对神经节细胞起到保护作用,其作用机制可能与激活Notch1/Hes-1信号通路有关。

调脾安肠方对裸鼠结肠癌肝转移灶miR-34a-5p、Notch1/NF-κB表达的影响

目的探讨调脾安肠方对裸鼠结肠癌肝转移(colorectal cancer liver metastasis,CLM)灶组织中MicroRNA-34a-5p(miR-34a-5p)及其靶基因Notch1/核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路表达的影响。方法选取30只雄性Balb/c裸鼠随机分为空白组、模型组、中药组,每组10只。脾脏原位注射HCT-116人结肠癌细胞(细胞数约为1×107个/mL)法构建CLM模型。中药组在CLM造模完成2周后开始调脾安肠方(2 g/mL,每日0.2 mL)灌胃2周,空白组和模型组同期予等体积0.9%生理盐水灌胃。苏木素—伊红染色观察肝转移灶病理组织形态;蛋白免疫印迹法测定肝转移灶Notch1、NF-κB p65蛋白水平;实时荧光定量PCR测定肝转移灶miR-34a-5p及Notch1、NF-κB p65 mRNA水平。结果与模型组比较,中药组裸鼠镜下病理转移灶面积明显减小,核分裂像减少,提示调脾安肠方抑制了结直肠癌细胞在肝脏的定植和迁移。与空白组比较,模型组肝转移灶中miR-34a-5p含量显著降低(P<0.01),Notch1、NF-κB p65蛋白表达升高(均P<0.05),Notch1、NF-κB p65的mRNA表达显著升高(均P<0.01)。与模型组比较,中药组Notch1蛋白及mRNA表达降低(P<0.05),NF-κB p65的mRNA表达显著降低(P<0.01)。miR-34a-5p与Notch1 mRNA在结肠癌肝转移灶组织中表达水平呈负相关(r^(2)=0.8845,P<0.05),Notch1与NF-κB p65在结肠癌肝转移灶组织中mRNA表达水平呈显著正相关(r^(2)=0.9291,P<0.01)。结论中药复方调脾安肠方能抑制裸鼠结肠癌肝转移灶形成,其机制可能与通过抑癌基因miR-34a-5p靶向负性调节Notch1/NF-κB通路表达有关。

基于Notch1/Jagged1/RBP-Jκ/Hes1信号通路调控巨噬细胞极化探讨复方雷公藤制剂改善关节炎症的机制

目的基于Notch1/Jagged1/RBP-Jκ/Hes1信号通路调控巨噬细胞极化探讨复方雷公藤制剂对佐剂关节炎大鼠关节炎症的影响。方法将30只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、复方雷公藤组、甲氨蝶呤组、Notch1抑制剂组,每组6只,除正常组外,其余组大鼠构建佐剂关节炎模型。致炎后第19天开始,复方雷公藤组给予340 mg/L复方雷公藤制剂混悬液灌胃,每天1次;甲氨蝶呤组给予0.95 mg/L甲氨蝶呤混悬液灌胃,每周1次;Notch1抑制剂组给予0.56 mg/L Notch1抑制剂混悬液尾静脉注射,隔天1次;正常组及模型组给予生理盐水灌胃,每天1次。各组均连续干预30 d。检测各组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数;末次灌胃结束后,HE染色观察关节滑膜组织病理学形态,ELISA法检测血清IL-1β、IL-4、IL-10、IL-13、TNF-α水平,流式细胞术检测外周血炎症极化标志物CD86、CD206表达情况,免疫组化及免疫印迹法检测关节滑膜组织中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ、Hes1蛋白表达情况。结果与正常组比较,模型组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数、外周血CD86表达占比及血清IL-1β、TNF-α水平和关节滑膜组织中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ、Hes1蛋白相对表达占比均明显升高(P均<0.05),外周血CD206表达占比及血清IL-4、IL-10、IL-13水平均明显降低(P均<0.05);与模型组比较,复方雷公藤组、甲氨蝶呤组、Notch1抑制剂组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数(除Notch1抑制剂组)、外周血CD86表达占比及血清IL-1β、TNF-α水平和关节滑膜组织中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ、Hes1蛋白相对表达占比均明显降低(P均<0.05),外周血CD206表达占比及血清IL-4、IL-10、IL-13水平均明显升高(P均<0.05)。结论复方雷公藤制剂可有效减轻佐剂关节炎大鼠关节炎症反应,其机制可能与抑制Notch1/Jagged1/RBP-Jκ/Hes1信号通路轴调控巨噬细胞极化,抑制促炎细胞因子的分泌有关。

外周血单个核细胞Notch1水平与稳定性心绞痛患者侧支循环形成的关系

目的:探讨外周血单个核细胞Notch1水平与稳定性心绞痛(SAP)患者冠状动脉侧支循环(CCC)形成的关系。方法:选择2018~2019年在广州市第一人民医院心内科住院的SAP患者100例,患者均接受冠状动脉造影检查并证实左前降支、回旋支、右冠状动脉至少1支血管存在≥90%狭窄。根据Rentrop分级将入选患者分为CCC良好组(Rentrop分级2~3级)56例和CCC不良组(Rentrop分级0~1级)44例,并选择同期门诊进行健康体检的50例健康人群作为对照组。检测患者外周血单个核细胞Notch1水平及血清血管内皮生长因子(VEGF)的水平,分析Notch1,VEGF水平与患者CCC的关系及Notch1与VEGF的相关性。结果:CCC良好组SAP患者外周血单个核细胞Notch1相对表达量[(5.92±0.91)]、血清VEGF水平[(342.47±60.53)ng/L]显著高于CCC不良组[(4.82±0.92)、(273.75±61.44)ng/L]及对照组[(3.92±0.78)(257.32±52.63)ng/L],差异均有统计学意义(P<0.05)。CCC良好组患者外周血单个核细胞Notch1水平与血清VEGF水平呈正相关(r=0.637,P<0.05);CCC不良组患者中两者无显著相关性(r=0.201,P>0.05)。多因素Logistic回归分析外周血单个核细胞Notch1与血清VEGF水平均是SAP患者CCC良好的独立预测因素(P<0.05)。结论:SAP患者外周血单个核细胞Notch1水平及血清VEGF水平与患者CCC形成良好相关,Notch1信号通路调控VEGF表达可能是影响患者CCC形成的重要机制之一。

重复经脊髓磁刺激对Notch1通路调控小鼠脊髓神经干细胞激活效应的作用

目的:观察重复经脊髓磁刺激(repetitive trans-spinal magnetic stimulation,rTSMS)通过Notch1通路对脊髓神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的作用。方法:孕龄16周C57BL/6小鼠处死后,迅速分离胎鼠全长脊髓,体外培养小鼠脊髓来源NSCs,通过单细胞测序及RNA速率分析检测脊髓NSCs亚群及速率变化特征。将体外培养的NSCs分为对照组、干预组及实验组。对照组将刺激探头置于培养皿上,不给予rTSMS刺激干预;干预组将刺激探头置于培养皿上,采用20Hz高频rTSMS、1500个脉冲刺激;实验组在转染Notch1 shRNA慢病毒后,进行rTSMS刺激,方案同干预组。采用Western blot检测各组Notch1表达量,免疫荧光染色和克隆球形成实验检测NSCs激活情况。结果:体外培养的脊髓NSCs可以诱导分化成为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,单细胞测序显示NSCs其可分为6个亚群并具有特殊异质性,Notch1主要表达在dNSCs和pNSCs两个亚群中。Notch1 shRNA慢病毒转染第5天后,细胞中Notch1蛋白表达量明显下降(对照组1.080±0.086 vs实验组0.520±0.041,P<0.05)。随后对照组给予假刺激,干预组及实验组给予rTSMS刺激,发现rTSMS显著提高NSCs内Notch1表达(对照组1.030±0.068 vs干预组1.480±0.087,P<0.05)。rTSMS干预后克隆球直径增大(对照组88.5±7.5 vs干预组106.2±8.8 vs实验组89.2±8.1,P<0.05)和BrdU阳性细胞率提高(对照组38.6±3.7 vs干预组50.3±4.6,P<0.05),有统计学差异。Notch1 shRNA干扰后,克隆球直径以及BrdU阳性细胞率均小于对照组,有统计学差异(P<0.05)。结论:rTSMS可在体外介导Notch1促进NSCs有效激活。

Notch1信号通路相关蛋白在急性期缺氧缺血脑损伤SD乳鼠脑组织中表达变化及其对神经细胞凋亡的作用

目的观察急性期缺氧缺血脑损伤SD乳鼠脑组织中Notch1信号通路相关蛋白(转录因子Notch1和其活性成分NICD以及其下游的蛋白HES1)表达变化及Notch1信号通路抑制后急性期缺氧缺血脑损伤SD乳鼠脑组织中神经细胞凋亡情况,以探讨Notch1信号通路在新生儿脑损伤中的作用及机制。方法18只3日龄SD乳鼠随机分成Notch1抑制组、模型组及对照组,均分为6只。Notch1抑制组于造模前30 min腹腔注射DAPT(100 mg/kg),然后缺血缺氧处理;模型组缺氧和缺血处理前腹腔注射1%DMSO;对照组接受假手术。采用Western blottting法检测各组Notch1信号通路蛋白(Notch1、NICD、HES1)及凋亡蛋白(Caspas-3、Bax、Bcl-2);通过尼氏染色和TUNEL染色观察脑组织结构变化和细胞凋亡情况。结果与对照组相比,模型组Notch1信号通路的转录因子NICD以及下游的调控蛋白HES1相对表达量升高(P均<0.05),促凋亡蛋白Caspas-3相对表达量升高(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少(P<0.05);与模型组相比,Notch1抑制组NICD和HES1蛋白相对表达量降低(P均<0.05),Caspas-3蛋白相对表达量降低(P<0.05),而Bcl-2相对表达量升高(P<0.05);与模型组比较,Notch1抑制组缺氧缺血损伤的脑组织结构明显改善,细胞凋亡数减少(P<0.05)。结论急性期缺氧缺血脑损伤SD乳鼠脑组织Notch1信号通路相关蛋白NICD、HES1升高,促凋亡蛋白Caspas-3表达增加、抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少;Notch1信号通路抑制后,急性期缺氧缺血脑损伤SD乳鼠脑组织中神经细胞凋亡减少;Notch1信号通路可通过促进脑组织中神经细胞凋亡从而诱发新生儿脑损伤。

基于Notch1通路探讨不同频率重复经颅磁刺激改善大脑中动脉闭塞大鼠学习记忆能力的机制

目的:观察不同频率重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS)对大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠学习记忆能力的影响及探讨其作用机制。方法:将造模成功的MCAO模型大鼠随机均分为模型组、低频组、高频组,同时另设假手术组,每组12只。低频组和高频组均予采用CCY-I型经颅磁刺激仪刺激,2次/日,连续14d;低频组:1Hz,部位:大鼠颅部左侧前额叶;高频组频率:10Hz,部位:大鼠颅部右侧前额叶。模型组和假手术组不予治疗仅同等情况下抓取束缚后归笼。神经行为学评分在术后第1天和第14天进行;水迷宫测试于术后3—7天进行;TTC染色、PCR及Western blot检测关键基因(Notch1、Hes1、Hes5)的mRNA及蛋白表达均在术后第14天干预结束后进行。结果:(1)神经功能缺损评分:与模型组相比,干预治疗14d后,高频组、低频组两组神经功能评分出现降低的情况(P<0.05),模型组与高频组之间无明显差异(P>0.05)。(2)Morris水迷宫实验:定向航行实验平均逃避潜伏期:低频组、高频组、假手术组均相比于同组前一天缩短,具有显著性差异(P<0.05);每天逃避潜伏期比较,高频组较模型组短,低频组较高频组短,具有显著性差异(P<0.05)。空间探索实验穿越平台次数:低频组和假手术组比较、高频组和模型组比较无显著性差异(P>0.05);高频组、模型组次数比假手术组少,低频组比模型组、高频组次数多,具有显著性差异(P<0.05)。(3)TTC染色:低频组、高频组梗死灶面积小于模型组。(4)PCR检测及Western Blot检测:高频组、低频组与模型组相比,Notch1、Hes1、Hes5的mRNA及蛋白表达量升高,具有显著性差异(P<0.05);低频组与高频组相比,Notch1、Hes1、Hes5的mRNA及蛋白表达无显著性差异(P>0.05)。结论:高/低频rTMS均能改善MCAO大鼠的学习记忆能力,且可能都予激活提高海马组织中的Notch1通路表达,提高海马突触可塑性有关。