Notch1胞内结构域真核表达质粒构建及在H9c2心肌样细胞的表达和生物学功能

目的构建Notch l胞内结构域(N1ICD)真核表达质粒,确定能在H9c2心肌样细胞内表达,并发挥生物学效应,为后续Notch1信号通路的研究提供实验依据。方法设计并合成1对含有BamH I和EcoR I酶切位点的特异性引物,以小鼠cDNA文库为模板,经PCR扩增得到了1 122 bp的目的片段,定向克隆至pcDNA 3.1/myc-His质粒,构建pcDNA3.1/N1ICD-myc-His真核表达质粒。通过双酶切及基因测序鉴定,经Lipofectamine 2000转染至H9c2心肌样细胞,48 h后提总蛋白,Western-blotting检测myc和Hes1,确定N1ICD能在H9c2细胞表达,并启动下游基因表达。结果表达质粒pcDNA3.1/N1ICD-myc-His双酶切及基因测序正确,N1ICD可在H9c2心肌样细胞内高效表达,具有Notch1生物学效应。结论真核表达质粒pcDNA3.1/N1ICD-myc-His构建成功,为Notch1信号通路在心血管领域的功能研究奠定了基础。

稳定表达Notch1胞内结构域肺腺癌细胞株的构建及鉴定

目的构建Notch1胞内结构域(N1ICD)稳定表达的肺腺癌A549细胞株。方法采用PCR方法扩增N1ICD基因,构建慢病毒重组质粒p HBLV-N1ICD-Zs Green-Puro(LV-N1ICD),采用PCR和基因测序鉴定重组质粒。高纯度无内毒素抽提慢病毒重组质粒和辅助包装原件载体质粒,使用慢病毒空载质粒(LV-Zs Green-Puro)和LVN1ICD共转染293T细胞包装慢病毒,利用药物筛选法测定病毒滴度。将A549细胞分成A549-N1ICD组和A549-Zs Green-Puro组,分别加入LV-N1ICD和LV-Zs Green-Puro,取制备好的慢病毒感染A549细胞,加入嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株,荧光显微镜观察转染效率,以带有绿色荧光的细胞初步视为稳定转染的细胞株。以A549细胞为对照组,进一步采用q PCR和Western blot方法分别检测N1ICD mRNA及蛋白表达。结果 PCR及基因测序结果表明pHBLV-N1ICD-Zs Green-Puro重组质粒构建成功。LV-N1ICD组病毒滴度为1×10~8TU/m L,LV-Zs Green-Puro组病毒滴度为1×108TU/m L。经嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察细胞形态无明显变化,A549-Zs Green-Puro组和A549-N1ICD组70%~80%的细胞带有绿色荧光。对照组、A549-Zs Green-Puro组、A549-N1ICD组的N1ICD mRNA相对表达量分别为1.59±0.11、1.09±0.10、70.81±6.39,A549-N1ICD组高于其他两组(P均<0.01)。三组N1ICD蛋白相对表达量分别为1.99±0.13、1.73±0.08、6.58±0.43,A549-N1ICD组高于其他两组(P均<0.01)。结论成功构建了稳定表达N1ICD的肺腺癌A549细胞株。

Notch1胞内结构域慢病毒表达载体及干扰载体的构建

目的构建高滴度大鼠N1ICD慢病毒过表达载体(LV-N1ICD)及N1ICD慢病毒干扰载体(LV-N1ICD-sh RNA)。方法以大鼠c DNA文库为模板,PCR法扩增N1ICD,通过定向克隆构建p GC-FU-N1ICD-3Flag穿梭质粒;设计4对N1ICD-sh RNA寡核苷酸序列,以构建GVC112-N1ICD-sh RNA干扰质粒,将p GC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-sh RNA共转293T细胞,检测Flag的表达,筛选理想的GVC112-N1ICD-sh RNA干扰质粒。将p GC-FU-N1ICD-3Flag或GVC112-N1ICD-sh RNA与p Helper 1.0、p Helper 2.0共转293T细胞,以包装LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA,分别利用Real-time PCR、药物筛选法进行病毒滴度测定。LV-N1ICD及LV-N1ICD-sh RNA分别感染H9c2心肌细胞,利用CCK-8检测细胞活力。结果 p GC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-sh RNA质粒经PCR、基因测序及Western-blotting验证构建成功,与p Helper 1.0、p Helper 2.0共转293T细胞后,取上清浓缩,分别获得高滴度LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA。LV-N1ICD可明显提高心肌细胞活力,LV-N1ICDsh RNA可降低心肌细胞活力。结论 LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA包装成功,具有Notch1信号通路生物学功能。

Notch 1信号途径的激活及其对宫颈癌细胞凋亡的影响

目的探讨Notch1信号途径在宫颈癌细胞中的激活,并研究其对宫颈癌细胞凋亡的影响。方法扩增人胎盘组织细胞内的全长NICD,并构建pcDNA3.1-NICD真核表达载体。通过脂质体转染宫颈癌细胞,筛选稳定表达NICD的宫颈癌细胞株。通过RT-PCR及Western blotting检测Notch1和Hes1基因的表达,并通过流式细胞仪观察其对宫颈癌细胞凋亡的影响。结果未处理及转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-NICD的Hela细胞中均存在Notch1及Hes1基因的表达,表明该信号通路在Hela细胞中处于激活状态。然而,转染NICD的宫颈癌细胞株Notch1及Hes1的表达明显升高,提示该通路可能在外源NICD的影响下处于过度激活状态。流式细胞仪检测结果显示,在未处理和转染pcDNA3.1的Hela细胞中,细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);但与未处理的和转染pcDNA3.1的Hela细胞相比,稳定表达NICD的Hela细胞的细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论外源的NICD通过Notch1信号途径能引起宫颈癌细胞的凋亡,提示Notch1可能成为治疗宫颈癌的分子靶点。

Notch1胞内段在鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞株中的表达研究

目的探讨Notch1胞内段(NIC)在非角化性鼻咽癌组织和细胞株中的表达。方法采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组化染色方法对鼻咽癌标本及不同分化程度鼻咽癌细胞株进行检测。结果 RT-PCR检测显示不同鼻咽癌细胞株中NIC基因均有表达,但分化程度高的CNE1细胞株表达最明显;同期进行的免疫组化染色结果与之相似;对鼻咽癌标本的免疫组化染色结果显示:鼻咽癌组织中NIC的表达高于鼻咽慢性黏膜炎症组织(P=0.005),而且NIC的表达强度与细胞分化程度密切相关(P<0.05),与患者性别、年龄无相关性(P>0.05)。另外,在未分化型鼻咽癌中,癌巢内几乎无阳性表达,淋巴细胞阳性表达多;而在分化型鼻咽癌中癌细胞阳性表达明显,可见于胞膜、胞质及胞核。结论 Notch信号系统参与鼻咽癌的发生,其中Notch1的表达与鼻咽癌的分化程度相关。

大鼠Notch1胞质段的克隆及其表达

Notch 1信号途径参与决定细胞命运 ,其水解后产生的活性片段———胞质段 (Notch 1intracellularcytoplasmicdomain ,NICD)能被转运进核 ,激活下游靶基因的表达 .Notch 1参与细胞的增殖、分化、程序性死亡、发育过程中的形态发生和器官形成等许多重要过程 .为了获得重组的NICD ,以大鼠脑cDNA文库为模板 ,用PCR方法扩增出编码NICD的基因片段 ,克隆至谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX KG中 ,并在大肠杆菌中获得较高水平的表达 .表达的融合蛋白GST NICD分子质量约为 12 0ku左右 ,以包涵体和可溶性两种形式存在 ,易于亲合层析纯化 .为制备抗体和进一步的功能研究奠定了基础 .

人胰岛素样生长因子1受体β结构域蛋白的原核表达及活性检测

目的构建人胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)β亚基胞外结构域(ED)和胞内激酶(PKD)结构域的原核表达载体,获得纯化的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法用PCR方法从乳腺cDNA文库中扩增IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体。重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用Western blot法检测融合蛋白表达,最后用GST pull-down技术检测纯化蛋白与已知蛋白表皮生长因子受体2驱动的细胞运动调节蛋白(MEMO)的相互作用。结果构建得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,测序后与目的序列一致;在Rossate菌中诱导表达出与预期位置相符的目的蛋白,并经过Western blot检测,融合蛋白成功表达;纯化得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD两个融合蛋白,GST pull-down证明蛋白GST-IGF1Rβ-PKD可以和MEMO相互作用。结论成功克隆GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因,并获得活性良好的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD蛋白。

过表达Notch1的胞内段基因对人牙周膜干细胞增殖能力影响

目的:探讨过表达Notch1的胞内段(Notch1intracellular domain,NICD)基因对人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)增殖能力的影响。方法:构建含NICD基因过表达的逆转录病毒颗粒,并将其转染至牙周膜干细胞,构建过表达NICD的细胞株PDLSCs/NICD,转染48h后观察细胞一般状态。PDLSCs/NICD为实验组,以PDLSCs/wt为正常细胞组和PDLSCs/vector空病毒转染组作为对照,通过实时定量聚合酶链锁反应(quantitative Real-time-Polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot检测NICD mRNA及其蛋白的表达;细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测细胞的增殖情况;Transwell实验检测细胞的迁移能力。结果:Western blot和qRT-PCR结果显示,与PDLSCs/wt组和PDLSCs/vector组比较,PDLSCs/NICD组的NICD蛋白表达水平及其mRNA表达水平均明显升高(P<0.05);CCK-8结果提示,与PDLSCs/vector组比较,PDLSCs/NICD组细胞增殖速度加快,Transwell实验结果显示,PDLSCs/NICD组的细胞迁移(40.20±1.74)明显高于PDLSCs/vector组(21.20±1.18)。结论:NICD基因过表达的人PDLSCs在一定程度上增殖及迁移能力加强。

白血病细胞中共表达P2X7受体和Notch1胞内区

本研究旨在构建野生型及N187D突变型P2X7与ICN1基因的共表达载体,并在白血病细胞中表达,为进一步探讨P2X7在白血病发展中的作用奠定基础。采用Overlap PCR法,通过2A连接,构建野生型或N187DP2X7与ICN1的共表达载体;经DNA序列分析验证后,包装病毒、感染K562细胞并经细胞分选获得稳定感染细胞系。采用RT-PCR、Western blot、胞浆游离钙离子浓度测定等方法,验证外源基因的表达及P2X7受体的功能。结果表明,序列分析显示载体构建正确;包装病毒对K562细胞感染效率40%-70%,流式分选获得稳定表达细胞株;RT-PCR结果显示,P2X7受体和/或ICN1基因可在对应的稳定表达细胞株中高效表达;Western blot也证明,P2X7受体可在感染编码P2X7受体基因病毒的K562细胞中高效表达;胞浆游离钙离子浓度检测显示,在BzATP刺激下,表达野生及N187D突变型P2X7的K562细胞胞浆游离钙离子浓度持续升高。结论:本研究在白血病细胞中成功共同高表达P2X7受体与ICN1,为进一步探讨野生型和N187D突变型P2X7受体在白血病发展中的作用奠定基础。

Notch家族4个蛋白质对人胰腺癌细胞HPAC中YY1和EGFR表达的影响

Notch信号通路是肿瘤形成过程中一种重要的信号通路,其中心分子为Notch受体.Notch受体为细胞膜上的单次跨膜蛋白,介导细胞间信号转导,哺乳动物细胞内包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4的4个成员.Notch家族4个蛋白质在结构和功能上存在差异.前期研究显示,Notch1信号通路与转录因子YY1(YING-YANG 1)、表皮生长因子受体(EGFR)间存在调控作用.本研究在人胰腺癌细胞HPAC中,采用RNA干扰技术,分别降低细胞中Notch家族4个蛋白质的表达,检测YY1和EGFR在m RNA和蛋白质水平上的表达;并构建相应的激活形式的Notch受体——Notch胞内结构域(Notch intracellular domain,NICD)真核表达质粒,在HPAC细胞中分别过表达4种NICD,检测其对YY1和EGFR表达水平的影响.结果显示,降低细胞中Notch1或Notch3的表达,均使HPAC细胞中EGFR m RNA和蛋白质水平升高(P<0.05),而降低Notch2和Notch4后,EGFR m RNA和蛋白质水平没有改变(P>0.05).分别降低4个Notch的表达,对YY1的蛋白质和m RNA表达水平均没有改变(P>0.05).在HPAC细胞中过表达N1ICD和N3ICD后,YY1和EGFR的蛋白质水平降低(P<0.05),而过表达N2ICD和N4ICD后,YY1和EGFR蛋白质水平没有改变(P>0.05).分别过表达4种NICD均没有改变YY1和EGFR的m RNA表达水平(P>0.05).初步得出结论是,在HPAC细胞中,Notch信号通路经Notch1和Notch3影响EGFR的表达.Notch1和Notch3对EGFR的表达可能具有负调控作用.在Notch1和Notch3过度激活时,这种调控作用通过YY1介导.本文可为深入研究Notch信号通路对胰腺癌发生发展的作用机制提供有意义的参考.

重组腺病毒过表达Notch1受体胞内结合域(NICD1)外源性激活Notch信号通路

目的:构建Notch1受体胞内结合域(Notch1 intracellular domain,NICD1)的重组腺病毒AdNICD1,探讨外源性过表达AdNICD1对Notch信号通路激活的影响。方法:利用高保真PCR(high fidelity PCR,Hi-Fi PCR)扩增NICD1编码区,并通过Gibson Assembly方法将其克隆至腺病毒载体中,经过菌落PCR、测序鉴定后,在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,再次通过质粒PCR鉴定,然后运用PacⅠ酶切线性化后用重组腺病毒载体转染过表达pTP基因的人胚肾293细胞(human embryo kidney 293 cell line,HEK293)中进行包装,收取病毒后使用过表达pTP基因的HEK293细胞扩增重组腺病毒AdNICD1。运用AdNICD1感染脂肪来源的间充质干细胞(immortalized multipotent adipose-derived mesenchymal stem cells,iMAD),检测病毒感染效率;通过Q-PCR检测NICD1和Notch下游基因表达情况;利用Westernblot检测NICD1在蛋白水平的表达情况。结果:成功构建过表达NICD1的重组腺病毒并有效感染iMAD;利用AdNICD1可明显增加NICD1在基因和蛋白水平的表达,并激活Notch信号下游基因的表达。结论:成功构建过表达NICD1的重组腺病毒,并有效激活Notch信号通路。

5-氮杂胞苷可通过抑制Notch1通路诱导食管癌细胞凋亡

背景与目的:5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-azaC)作为一种DNA甲基转移酶抑制剂在临床上已用于多种恶性肿瘤的治疗,但有关5-azaC在食管癌中作用的研究相对较少。凋亡逃逸是肿瘤主要特点之一,也是抗肿瘤治疗研究的热点。Notch1信号通路是促进食管癌发生、发展的重要通路之一,与细胞的增殖、侵袭及凋亡等密切相关。该研究旨在探讨5-azaC对食管癌细胞凋亡的作用及其对Notch1信号通路的影响,从而探索5-azaC作用可能涉及的机制。方法:采用50μmol/L浓度的5-azaC处理TE-1及OE33两种食管癌细胞系;采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测5-azaC对细胞增殖的抑制效率;采用倒置显微镜观察细胞形态变化;采用流式细胞术、蛋白质印迹法(Western blot)检测两种细胞株在药物处理组与空白对照组的凋亡情况及抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-XL(B-cell lymphoma-extra large,BCL-XL)的表达;采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)及Western blot分别检测两种细胞系中Notch1 mRNA表达和蛋白水平的变化及其Notch细胞内区(Notch intracellular domain,NICD)蛋白水平的变化。结果:5-azaC可诱导食管癌细胞TE-1及OE33凋亡,并明显抑制两种细胞增殖;5-azaC作用于TE-1及OE33细胞时可使Notch1 mRNA表达升高,而NICD蛋白表达水平显著下降。结论:5-azaC对食管鳞癌细胞株TE-1及食管腺癌细胞株OE33均有较强的促凋亡作用,其作用机制可能是通过下调NICD蛋白从而抑制Notch1信号通路。

VEGF/VEGFR2,Dll4/Notch1信号通路在基底细胞癌和脂溢性角化病中的表达及关系

目的:比较VEGF/VEGFR2,Dl 4/Notch1信号通路在基底细胞癌和脂溢性角化病中的表达及关系。方法采用免疫组化方法,对60例基底细胞癌和31例脂溢性角化病的石蜡包埋标本进行VEGF、VEGFR2、Dl 4、Notch1水平的检测,并进行相关性分析。结果 VEGF、VEGFR2在基底细胞癌中的阳性率分别为67.5%、43.2%,高于脂溢性角化病的37.4%、15.2%,也高于正常皮肤组织33.5%、13.1%,差异具有统计学意义(P<0.05)。 Dl 4、Notch1在基底细胞癌中的阳性率分别为12.6%、11.9%,低于脂溢性角化病的19.3%、21.8%,也低于正常皮肤组织21.6%、24.7%,差异具有统计学意义(P<0.05)。VEGF、VEGFR2在脂溢性角化病的阳性率分别为37.4%、15.2%,高于正常皮肤组织33.5%、13.1%,差异无统计学意义(P>0.05)。Dl 4、Notch1脂溢性角化病的阳性率分别为19.3%、21.8%,低于正常皮肤组织21.6%、24.7%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 VEGF、VEGFR2、Dl 4、Notch1与上皮源性皮肤肿瘤的发生、发展、预后有关。

VEGF-VEGFR2,Dll4-Notch1信号通路在基底细胞癌和鲍温病中的表达及关系

目的:比较VEGF-VEGFR2,Dl 4-Notch1信号通路在不同类型上皮源性肿瘤中的表达及关系。方法采用免疫组化方法,对60例基底细胞癌和26例鲍温病的石蜡包埋标本进行VEGF、VEGFR2、Dl 4、Notch1蛋白水平的检测,并进行相关性分析。结果 VEGF、VEGFR2、在基底细胞癌中的表达高于鲍温病及正常皮肤组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。而Dl 4、Notch1在基底细胞癌中的表达低于鲍温病及正常皮肤组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 VEGF、VEGFR2、Dl 4、Notch1与不同种类上皮源性皮肤肿瘤的发展和预后有关。

神经调节蛋白1/转化生长因子β1对血管平滑肌细胞骨架的作用

目的探讨神经调节蛋白1/转化生长因子β1(NRG-1/TGF-β1)对血管平滑肌细胞骨架的作用。方法取小鼠血管组织,采用免疫荧光法对NRG-1干预后细胞收缩功能变化进行分析,采用鬼笔环肽、免疫荧光共定位分析NRG-1/TGF-β1表达,采用GST融合蛋白沉降技术检测分析NRG-1-ICD与α-肌动蛋白(α-SMA)的共位性。结果 TGF-β1在人主动脉血管平滑肌细胞中可上调NRG-1表达,经免疫荧光染色可发现平滑肌细胞标志蛋白α-SMA与NRG-1存在共位性;经RT-PCR及Western blot检测分析发现,在大鼠平滑肌细胞、人平滑肌细胞以及人内皮细胞中均存在NRG-1的mRNA表达。结论在转录和翻译水平上TGF-β1可上调NRG-1的表达;在细胞收缩中,TGF-β1对于α-SMA与NRG-1-ICD之间的表达可以起到促进作用。

胞磷胆碱钠片联合电脑认知功能系统训练对脑卒中认知功能障碍患者血清NPAS4、γ-GGT及ICAM-1的影响

目的探讨胞磷胆碱钠片联合电脑认知功能系统训练对脑卒中认知功能障碍患者血清神经元PAS结构域蛋白4(NPAS4)、γ-谷酰转肽酶(γ-GGT)及细胞间黏附因子-1(ICAM-1)的影响。方法前瞻性选取2019年1月至2020年12月在四川大学华西医院康复医学中心治疗的脑卒中认知功能障碍患者136例,采用随机数字表法将患者分为观察组(n=67)和对照组(n=69)。对照组给予电脑认知功能系统训练,观察组在对照组基础上加用胞磷胆碱钠片治疗,治疗8周。观察两组简易精神状态检查表(MMSE)、日常生活活动能力量表(ADL)、SF-36量表及血清NPAS4、γ-GGT及ICAM-1的差异。结果观察组治疗8周后,MMSE和ADL评分分别为(22.43±1.94)、(77.80±9.62)分,明显高于对照组[(20.05±1.82)、(68.84±9.14)分],差异均有统计学意义(P<0.05)。观察组治疗8周后,SF-36量表生理功能、生理职能、总体健康、情感职能和心理健康得分分别为(77.86±6.80)、(81.14±5.74)、(78.81±6.40)、(72.24±5.84)、(81.10±6.90)分,明显高于对照组[(67.90±7.64)、(73.20±6.09)、(72.03±6.81)、(62.29±5.94)、(65.52±6.43)分],差异均有统计学意义(P<0.05)。观察组治疗8周后,血清NPAS4、γ-GGT及ICAM-1分别为(1.98±0.90)mg/L、(21.03±9.97)U/L和(184.13±51.60)μg/mL,明显低于对照组[(2.83±0.81)mg/L、(29.78±8.87)U/L、(228.40±60.43)μg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。NPAS4、γ-GGT及ICAM-1与MMSE评分呈负相关(P<0.05)。结论胞磷胆碱钠片联合电脑认知功能系统训练有助于脑卒中认知功能障碍患者康复,降低血清NPAS4、γ-GGT及ICAM-1水平,同时血清NPAS4、γ-GGT及ICAM-1水平与患者认知功能障碍有关。

Notch-1/NICD信号在普罗布考保护大鼠急性脑缺血后再灌注损伤中的作用

目的：研究普罗布考对大鼠急性脑缺血再灌注损伤后大脑的保护作用及其与Notch-1/Notch胞内域（NICD）蛋白信号通路的关系。方法：SD大鼠随机分为假手术组、缺血组及普罗布考组。采用大脑中动脉闭塞（MCAO）法建立局灶性脑缺血再灌注模型，经普罗布考腹腔注射处理后，采用转角试验判断神经功能，2,3,5氯化三苯四氮唑（TTC）染色法测量脑梗死体积，干湿法测定脑组织含水量，免疫印迹检测Notch-1和NICD蛋白的表达，免疫酶联反应检测血清中炎症因子白介素8（IL-8）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量。结果：普罗布考可改善急性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能，减轻脑水肿；与缺血组相比，普罗布考治疗组Notch-1/NICD蛋白表达降低，IL-8和TNF-α分泌也相应减少。结论：普罗布考可激活Notch-1/NICD信号通路，进而调节IL-8和TNF-α的表达，发挥对急性脑缺血再灌注损伤脑的保护作用。

ICAP-1对脐静脉内皮细胞PI3K表达及细胞增殖的影响

目的研究整合素胞浆结构域关联蛋白-1(ICAP-1)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及PI3K信号通路表达的影响,以进一步研究其生物学作用及其在血管形成中的作用机制。方法通过构建PCDNA3.1-ICAP-1质粒并转染HUVEC,采用MTT法测定HUVEC增殖化,WesternBlot检测ICAP-1及PI3K表达。结果PCDNA3.1-ICAP-1转染组ICAP-1和PI3K表达明显增加,PCDNA3.1-ICAP-1转染组与正常对照组、PCDNA3.1-GFP转染组比较表达差异有统计学意义(P<0.05)。PCDNA3.1-ICAP-1转染组较PCDNA3.1-GFP转染组和正常对照组细胞增殖能力增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论ICAP-1具有促进内皮细胞增殖的作用,ICAP-1可能通过上调PI3K表达,促进内皮细胞增殖达到促进血管新生的作用。

主动脉瓣膜钙化中胰高血糖素样肽-1对Notch1-Sox9信号通路的调控作用

目的:探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及GLP-1受体(GLP-1R)下游信号通路对主动脉瓣膜间质细胞钙化的调控作用。方法:收集16例因主动脉瓣病变行置换术患者(瓣膜钙化组)和20例因其他原因行心脏移植但瓣膜正常患者(对照组)的主动脉瓣。苏木精-伊红染色(HE染色)和茜素红染色法检测瓣膜结构变化及钙化情况,免疫组织化学染色检测GLP-1R表达情况。培养原代小鼠瓣膜间质细胞,分为正常培养组、钙化培养组和钙化培养+GLP-1组,茜素红染色检测钙化情况,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测Sox9 mRNA表达水平,Western blot检测GLP-1R、Sox9、Notch胞内结构域(NICD)的蛋白表达水平,免疫荧光法检测Sox9细胞定位及NICD入核情况。结果:与对照组比较,瓣膜钙化组人主动脉瓣组织茜素红染色显示阳性区增加,免疫组织化学染色显示GLP-1R表达水平下降。体外培养小鼠主动脉瓣膜间质原代细胞,与正常培养组比较,钙化培养组光镜下发现细胞出现形态改变,茜素红染色阳性区域增加,GLP-1R蛋白表达水平明显下降(P<0.05),NICD入核量减少,NICD蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。与钙化培养组比较,钙化培养+GLP-1组光镜下细胞形态基本正常,茜素红染色阳性区域减少,GLP-1R蛋白表达水平明显升高,Sox 9的mRNA及蛋白表达水平明显升高,NICD入核量增加,NICD蛋白表达水平明显升高(P均<0.05)。结论:GLP-1通过激活其受体GLP-1R调控主动脉瓣膜间质细胞中NICD入核,诱导Sox9表达升高,抑制主动脉瓣膜钙化。

拟南芥LRR-RLK家族蛋白CLV1胞外域的可溶性表达与纯化

大肠杆菌NusA蛋白与拟南芥LRR-RLK家族蛋白CLAVATA1(CLV1)胞外结构域(Ectodomain,ECD)融合表达,实现了蛋白CLV1-ECD的可溶性表达;CLV1-ECD与其配体蛋白CLAVATA3(CLV3)共表达,可以明显提高它的水溶性。该实验方法快速简易地获得了大量纯化的CLV1-ECD蛋白,避免了包涵体变性与复性的复杂过程,为植物CLAVATA信号系统的进一步研究奠定了基础。