特发性震颤患者NOTCH2NLC基因动态突变筛查

目的对110例特发性震颤(ET)患者进行致病基因变异鉴定。方法收集在北京协和医院神经内科就诊的110例ET患者的临床资料并采集外周血,从患者外周血中提取基因组DNA。通过三引物PCR(TP-PCR)对ET患者进行NOTCH2NLC动态突变检测,由于ET与多种神经变性病机制相关,因此通过定制的二代测序筛查子组(panel)对神经退行性疾病相关基因的罕见变异进行筛查。结果在110例ET患者队列和187名匹配的对照个体中,ET患者组发病年龄为(36.30±17.64)岁,有家族病史者占74.8%。未发现NOTCH2NLC异常三核苷酸重复扩增,ET患者(GGC)n重复次数在10~47(平均18.6±5.4)次内。变异负荷分析显示ET与PLA2G6罕见变异有相关性;在4例PLA2G6患者中发现了3个罕见的意义未明变异。结论NOTCH2NLC动态突变在ET患者中罕见,提示需要筛选ET多重发病机制。

家系不宁腿综合征/Willis-Ekbom病患者NOTCH2NLC基因研究

目的探讨家系不宁腿综合征/Willis-Ekbom病患者NOTCH2NLC基因是否存在GGC异常重复扩增。方法收集2016年1月至2020年10月作者医院诊治的家系不宁腿综合征/Willis-Ekbom病患者35例,对先证者提取DNA,进行重复引物聚合酶链反应PCR(RP-PCR)和富含GC的毛细管电泳的PCR(GC-PCR),以确定NOTCH2NLC基因中GGC重复序列的大小。结果35例家系不宁腿综合征/Willis-Ekbom病患者均未检测到GGC重复序列异常扩增。结论NOTCH2NLC基因GGC异常重复扩增可能不参与不宁腿综合征/Willis-Ekbom病的发病机制。

神经元核内包涵体病和NOTCH2NLC基因

神经元核内包涵体病(neuronal intranuclear inclusion disease,NIID)是一种十分罕见的疾病,早期病例报道常见于欧美人群,以儿童及少年多见,后发现亚裔成人更为常见。随着对此病研究的深入,特别是皮肤活检结果及影像特征性“绸带征”的发现,对其有了革命性的认识,发现该病在国内并非罕见。目前尚缺乏统一的NIID诊断标准,多采用Sone等2016年提出的成人NIID的诊断流程。2019年发现了NOTCH2NLC基因中GGC异常重复扩增与NIID有关,随后相继发现其与阿尔茨海默病、额颞叶痴呆等多种神经退行性疾病有关。现就NIID和NOTCH2NLC基因的相关研究进展进行总结,以提高临床医师对此病的认识。

NOTCH2NLC基因与神经系统疾病的相关性研究进展

Notch信号通路可调控各谱系细胞及组织的分化,参与细胞的增殖、分化、凋亡,决定神经前体细胞增殖和神经元分化的时间和持续时间,其信号通路中某一关键分子突变都有可能导致一系列的神经系统疾病。NOTCH2NL作为Notch信号和神经发生的特异性修饰物,可以激活NOTCH信号通路,参与许多神经变性疾病的生理病理过程。本文就NOTCH2NL作用机制及NOTCH2NLC基因在神经变性疾病的研究进展进行综述。

陕北白绒山羊Notch2基因多态性与绒毛和生长性状的相关性分析

【目的】探究陕北白绒山羊Notch2基因插入/缺失(insertion/deletion, InDel)遗传多态性及其与绒毛和生长性状的相关性,为陕北白绒山羊分子辅助育种提供理论依据。【方法】采集1 469只成年雌性陕北白绒山羊耳组织,提取基因组DNA,并测定绒长、毛长、体长、体高等绒毛与生长性状数据。参考GenBank和Ensembl数据库提供的山羊Notch2基因InDel遗传变异信息设计引物,利用PCR扩增和直接测序法检测Notch2基因17个InDels突变的多态性,并分析其与陕北白绒山羊绒毛和生长性状的相关性。【结果】陕北白绒山羊Notch2基因分别在第15内含子区的12 bp InDel(rs665021370)和第25内含子区的21 bp InDel(rs653705114)存在多态性,且2个InDels位点均存在插入/插入型(II)、杂合型(ID)和缺失/缺失型(DD)3种基因型,这2个位点均属于低度多态(P<0.25),且处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。关联分析结果表明,Notch2基因rs665021370位点突变与陕北白绒山羊体高或体长呈显著或极显著相关(P<0.05;P<0.01);rs653705114位点突变与陕北白绒山羊毛长、胸宽和体高呈显著或极显著相关(P<0.05;P<0.01)。2个InDels位点不属于强连锁关系。【结论】Notch2基因rs665021370和rs653705114位点突变对陕北白绒山羊绒毛或生长性状有显著影响,可作为陕北白绒山羊优良性状选育的分子标记。

基于Notch信号通路探讨芪蛭皱肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病大鼠Th1/Th2免疫平衡的调节机制

目的探讨果蝇双翅边缘缺刻同源基因(Notch)信号通路在慢性阻塞性肺疾病(COPD)辅助性T细胞1(Helper T cells 1,Th1)和辅助性T细胞2(Helper T cells 2,Th2)失衡中的作用及芪蛭皱肺颗粒的干预机制。方法70只Wistar大鼠随机挑选10只作为空白对照组,其余大鼠均采用香烟烟雾(CS)联合气管滴注脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)法建立COPD模型,空白对照组及造模组各随机挑选3只大鼠验证造模是否成功。造模结束进行灌胃给药干预,造模组大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组(67.5μg·kg^(-1))及芪蛭皱肺颗粒高中低剂量组(3.24、1.62、0.81 g·kg^(-1)),分别给予生理盐水、醋酸地塞米松混悬液、芪蛭皱肺高、中、低剂量混悬液进行灌胃干预,空白对照组同模型对照组,灌胃等体积生理盐水。经28天造模及28天治疗后,采用动物肺功能测试系统检测吸气峰流速(Peak Inspiratory Flow,PIF)和呼气峰流速(Peak Expiratory Flow,PEF),处死大鼠提取肺脏、脾脏、血清及支气管肺泡灌洗液(BALF),苏木素-伊红(HE)染色评价肺组织病理变化,酶联免疫吸附实验法(ELISA)测定血清及BALF中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,流式细胞仪检测脾脏Th1/Th2细胞水平,免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肺组织Notch1、Hes家族发状分裂相关增强子1(Hes1)、Hey家族发状分裂相关增强子1(Hey1)蛋白水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR,RT-PCR)检测肺组织Notch1、Hes1、Hey1基因表达水平。结果与空白对照组比较,模型对照组大鼠肺功能显著降低(P<0.05),肺组织出现炎性细胞浸润、支气管结构破坏等病变,血清及BALF中TNF-α含量显著升高(P<0.05),脾Th1细胞百分比显著降低(P<0.05),Th2细胞百分比显著升高(P<0.05),肺组织Notch1、Hes1、Hey1蛋白及mRNA表达显著升高(P<0.05),差异均具有统计学意义;与模型对照组比较,各给药组大鼠肺功能显著升高(P<0.05),肺组织病理损伤均有所减轻,血清及BALF中TNF-α含量显著降低(P<0.05),脾Th1细胞百分比显著升高(P<0.05),Th2细胞百分比显著降低(P<0.05),肺组织Notch1、Hes1、Hey1蛋白及mRNA表达显著降低(P<0.05),差异均具有统计学意义。结论芪蛭皱肺颗粒通过抑制Notch信号通路调节Th1/Th2平衡,从而改善COPD大鼠肺功能及病理损伤,影响其免疫功能。

NOTCH2基因突变导致Hajdu-Cheney综合征一例报告

报告1例Hajdu-Cheney综合征(Hajdu-Cheney syndrome, HCS)患者的临床表现、影像特点、基因诊断和双膦酸盐治疗效果随访。先证者为12岁男孩,3年内反复骨折3次伴腰背痛,查体身材矮小伴特殊面容,双下肢不等长,双手手指粗短、指末端增粗,X线见椎体骨折、手指末端指骨溶解。全外显子检查发现NOTCH2基因c.6449_6450delCT(p.P2150Rfs*2)新发杂合变异,导致2 150位脯氨酸为精氨酸代替,发生移码突变,于下游第2号密码子处终止。诊断HCS,予以双膦酸盐、15个月,腰背痛缓解,无再发骨折,但指骨末端溶骨仍有进展。

鹿角脱盘对辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤Notch2基因表达和免疫功能的影响

目的:观察鹿角脱盘对辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤Notch2基因的表达和免疫功能的影响,探讨其在辐射致癌过程中的作用。方法:将90只近交系BALB/c小鼠随机分成对照组、照射组和照射给药组,每组30只。照射组和照射给药组小鼠采用X射线照射,建立胸腺淋巴瘤动物模型,照射后给予照射给药组小鼠喂饲含鹿角脱盘超微粉的鼠粮。6个月后,取全血和胸腺,采用RT-PCR和Western blotting法分别检测胸腺淋巴瘤组织中Notch2mRNA和蛋白表达水平;采用ELISA法检测血清免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)水平,应用SOD试剂盒检测血清中SOD活性。结果:照射组和照射给药组小鼠胸腺瘤发生率分别为53.33%(16/30)和36.67%(11/30);照射组小鼠胸腺瘤组织中Notch2mRNA和蛋白表达水平较对照组小鼠正常胸腺组织均明显升高(P<0.05),而照射给药组小鼠胸腺瘤组织中Notch2 mRNA和蛋白表达水平均低于照射组(P<0.05);照射组小鼠血清中IgG、IgA和IgM水平均低于对照组(P<0.05),而照射给药组小鼠血清中IgG、IgM和血红蛋白水平及SOD活性均高于照射组(P<0.05)。结论:电离辐射激活Notch2基因和蛋白的高表达及降低小鼠免疫功能可能是辐射诱发胸腺淋巴瘤的发生机制之一;鹿角脱盘可通过抑制Notch2基因和蛋白的表达及提高小鼠免疫功能而降低辐射致癌的发生率,起到抑制肿瘤的作用。

COX-2基因对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞生长及Notch信号通路的影响及其作用机制

目的探讨抑制环氧合酶-2(COX-2)基因表达对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞系MRC-5活力、胶原合成和转化及Notch信号通路的影响。方法将MRC-5细胞分为对照组、TGF-β1组、NC组和COX-2-siRNA组,各组细胞处理48 h,Western blotting检测COX-2、胶原合成相关的COL-Ⅰ和COL-Ⅲ、 EMT标志物α-SMA及Notch信号通路受体Notch1及配体Jagged1的蛋白表达;CCK8法检测各组细胞活力。结果 TGF-β1组COX-2的表达显著高于对照组,COX-2-siRNA组COX-2的表达显著低于TGF-β1组(P<0.05),NC组COX-2的表达与TGF-β1组差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,TGF-β1组细胞活力及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA、Notch1和Jagged1的蛋白表达均显著升高(P<0.05),与TGF-β1组比较,COX-2-siRNA组细胞活力及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA、Notch1和Jagged1的蛋白表达均显著降低(P<0.05)。结论抑制COX-2基因表达中可能通过降低MRC-5细胞活力、抑制细胞胶原合成和转化,并下调Notch信号通路,从而对肺纤维化起保护作用。

转染突变型Notch3基因对线粒体融合蛋白-2表达及下游信号通路的影响

目的探讨Notch3基因突变后对线粒体融合蛋白-2(mfn-2)的表达及其下游信号通路的影响,从而进一步阐明伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)的病理机制。方法利用脂质体法将Notch3野生型重组表达质粒(pcDNA3.1-Notch3)、突变型重组表达质粒(pcDNA3.1-Notch3-R90C)以及pcDNA3.1空载质粒分别瞬时转染到人主动脉平滑肌细胞中并培养。Real-time PCR及western-blot检测各组Notch3的表达;Real-time PCR检测各组mfn-2、bcl-2、survivin基因mRNA的表达;Western-blot检测各组mfn-2蛋白的表达;AV/PI双标法检测各组细胞凋亡情况。结果与空载质粒组和野生型组比较,转染突变型Notch3基因组中mfn-2表达水平明显增加(P<0.05)、bcl-2和survivin基因表达下调(P<0.05)以及细胞凋亡明显增加(P<0.05)。结论 Notch3基因突变后引起的mfn2表达上调及下游凋亡调控基因表达失衡可能是CADASIL发病的重要病理机制。

Notch 2在肌萎缩侧索硬化症SOD1^(G93A)转基因小鼠脊髓内的表达变化

目的明确肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)SOD1G93A转基因小鼠脊髓内Notch 2表达水平与ALS病程的关系。方法应用Notch基因阵列表达谱检测Notch信号通路相关分子在表达人突变SOD1基因的SOD1G93A转基因ALS小鼠及野生型鼠脊髓内的表达差异。应用real-time PCR、免疫组织化学染色、Western blot方法检测Notch 2在不同阶段各组小鼠脊髓内的表达变化。结果 Notch基因阵列表达谱聚类分析结果显示Notch 1、Notch 2在95d、122d SOD1G93A鼠脊髓内均显著增高,而Notch 4仅在122d SOD1G93A鼠升高明显。Notch下游靶基因HES1在108d SOD1G93A鼠脊髓内显著降低。RT-PCR结果证实Notch 2在SOD1G93A鼠脊髓内的表达变化。免疫组织化学标记显示Notch 2在SOD1G93A鼠、野生型鼠脊髓各部均有表达,Western blot结果显示Notch 2蛋白表达在95d SOD1G93A鼠增高显著。结论 Notch 2信号分子的表达随ALS疾病进展,在脊髓退变过程中变化显著,可能参与ALS疾病进程。

NOTCH2基因突变致Hajdu-Cheney综合征临床特征及随访并文献复习

目的探讨NOTCH2基因变异致Hajdu-Cheney综合征(HCS)的临床表现和致病基因特点。方法回顾分析1例HCS患儿的临床及随访资料,并复习相关文献。结果患儿,男,11岁8月龄。手指末端发育异常,特殊面容,身材偏矮,摔跤后胸椎压缩性骨折;影像学发现肢端骨溶解、颅底凹陷。高通量测序结果显示,患儿NOTCH2基因存在c.6449_6450 delCT,p.Pro 2150Argfs*2杂合变异,其父母该位点的基因型均无异常,为新生突变。结论基因检测有助于明确诊断HCS。

Notch1和Notch2对胰腺癌HPAC细胞中Hes家族靶基因的不同调控作用

目的研究Notch1、Notch2受体对胰腺癌HPAC细胞Notch信号通路下游Hes家族靶基因的影响。方法运用siRNA干扰技术分别干扰HPAC细胞中Notch1和Notch2基因,用Western blotting法检测Notch1和Notch2的干扰效率,用real-time PCR检测siRNA干扰后Notch下游靶基因Hes1、Hes2、Hes4和Hes6的mRNA表达水平;同时用Western blotting法检测Hes1的蛋白表达变化。结果与空白对照组(1.000±0.019)和siRNA对照组(0.908±0.039)相比,Notch1-siRNA转染组(0.124±0.005)的Notch1蛋白表达量显著降低。Notch1敲减降低了Hes1和Hes6的mRNA表达,Hes1与空白对照组和siRNA对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);Hes6与空白对照组和siRNA对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),对Hes2和Hes4的mRNA则没有影响。Hes2与空白对照组siRNA对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);Hes4与空白对照组和siRNA对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组(1.000±0.015)和siRNA对照组(0.990±0.017)相比Notch2-siRNA转染组(0.350±0.009)的Notch2蛋白表达量显著降低。Notch2敲减降低了Hes1的mRNA表达,Hes1与空白对照组和siRNA对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),而对Hes2、Hes4和Hes6的表达没有影响,Hes2与空白对照组和siRNA对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);Hes4与空白对照组和siRNA对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);Hes6与空白对照组和siRNA对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。Notch1和Notch2下调均不能引起Hes1蛋白水平变化。结论 HPAC细胞中Notch1的靶基因是Hes1和Hes6,而Notch2的靶基因是Hes1,提示不同Notch家族成员调控的靶基因有交叉但是不同。

法洛四联症患儿NOTCH2基因3'UTR区域突变分析

目的筛查法洛四联症(TOF)患儿中NOTCH2基因3'UTR区域存在的基因突变,探讨该区域突变影响NOTCH2基因表达的可能机制。方法选取152例诊断明确的TOF患儿(TOF组)为研究对象,107名健康儿童为对照组(CON组),PCR扩增NOTCH2基因3'UTR区域序列,所有扩增片段均进行双向测序。将所测NOTCH2基因3'UTR区序列与Gen Bank中的已知序列(NG_008163.1)通过BLAST程序对比,检出可能存在的基因突变。采用Pic Tar和Target Scan在线预测软件预测可能与NOTCH2基因3'UTR区域结合的微小RNA(miRNA),分析NOTCH2基因3'UTR区域突变对miRNA调控NOTCH2基因表达的影响。结果检测出NOTCH2基因3'UTR区域1个新发突变和5个已报道的单核苷酸多态性(SNP),分别为2 672位(157020T>G)、rs368873082(156595C>T)、rs835576(156691A>G)、rs3795664(156937C>T)、rs699779(156967T>C)和rs699780(156836T>C);5个已报道的SNP在TOF组与CON组中的等位基因频率差异均无统计学意义(P>0.05)。预测结果显示34种miRNA能与NOTCH2基因3'UTR区域结合,该突变并不位于34种miRNA与NOTCH2 3'UTR的结合区域。结论 NOTCH2基因3'UTR区域存在新突变157020T>G,该突变有可能通过空间构象影响miRNA与NOTCH2基因3'UTR区的结合效率,进而影响NOTCH2基因的正常表达;而该区域的5个SNP与TOF易感性无明显关联。

HMGA2基因调控Notch信号通路对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的:探讨下调HMGA2基因表达对高糖(HG)诱导的肾小管上皮细胞凋亡及Notch信号的影响。方法:分别用5、10、20和30 mmol/L的D-葡萄糖刺激人肾小管上皮HK-2细胞2 h及30 mmol/L的D-葡萄糖刺激HK-2细胞10 min、60 min和120 min,通过Western blot检测HMGA2蛋白的表达。将HK-2细胞分为4个处理组,即正常葡萄糖(NG)组、HG组、HG+si-HMGA2组和HG+NC组,其中siRNA转染参照LipofectamineTM 2000说明。处理细胞48 h,流式细胞术检测细胞凋亡率;活性氧簇(ROS)检测试剂盒测定细胞ROS含量;Western blot检测Notch1、Hes1、Bcl-2和Bax的蛋白表达。使用Notch信号通路抑制剂DAPT处理HK-2细胞,将细胞分为HG组、HG+DAPT组和HG+si-HMGA2+DAPT组,通过流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:不同浓度D-葡萄糖处理HK-2细胞及D-葡萄糖处理HK-2细胞不同时间均可明显上调HMGA2蛋白的表达,与5 mmol/L D-葡萄糖或0 min比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。与NG组比较,HG组HMGA2、Notch1和Hes1蛋白的表达明显升高,Bcl-2/Bax表达明显降低,细胞凋亡率明显升高,ROS含量明显升高(P<0.05);和HG组比较,HG+si-HMGA2组HMGA2、Notch1和Hes1蛋白表达明显降低,Bcl-2/Bax表达明显升高,细胞凋亡率降低,ROS含量明显降低(P<0.05)。HG+DAPT组的细胞凋亡率明显低于HG组,而HG+si-HMGA2+DAPT组的细胞凋亡率明显低于HG+DAPT组(P<0.05)。结论:下调HMGA2基因表达可通过调控Notch信号通路、降低细胞内ROS产生而抑制肾小管上皮细胞凋亡。

下调SLP-2基因表达抑制脑胶质瘤细胞增殖及诱导凋亡的机制研究

目的:探讨下调人Stomatin like protein 2(SLP-2)基因表达对脑胶质瘤细胞增殖凋亡的影响。方法:SLP-2的靶向siRNA序列转染人脑胶质瘤U251细胞(SLP-2敲低组),另设空白组(细胞未做任何处理)和阴性对照组(细胞转染无义siRNA序列),转染48 h后Western blot检测各组细胞中SLP-2、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Notch1、Hes1的蛋白表达;CCK8检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:阴性对照组SLP-2的蛋白表达与空白组差异无统计学意义(P>0.05),而SLP-2敲低组SLP-2的蛋白表达显著低于空白组(P<0.05);阴性对照组细胞存活率、细胞凋亡率、IL-6和TNF-α的mRNA表达及Bcl-2、Bax、Notch1、Hes1蛋白表达与空白组差异无统计学意义(P>0.05),而SLP-2敲低组细胞存活率、IL-6和TNF-α的mRNA表达及Bcl-2、Notch1、Hes1的蛋白表达显著低于空白组,细胞凋亡率及Bax蛋白表达显著高于空白组(P>0.05)。结论:下调SLP-2基因表达可显著抑制脑胶质瘤细胞增殖及诱导细胞的凋亡,下调炎症细胞因子IL-6和TNF-α的表达,其机制与抑制Notch1信号通路有关。

Fgl2基因对H9C2心肌细胞凋亡的影响

目的探讨纤维蛋白原样蛋白(Fgl)2基因对H9C2心肌细胞凋亡的影响及机制。方法空白试剂、阴性病毒和Fgl2 siRNA慢病毒感染H9C2心肌细胞,分别为空白对照组、阴性对照组、Fgl2-siRNA组,48 h后收集细胞,Western印迹检测各组细胞中Fgl2的蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western印迹检测酶切caspase3、Notch1、Hes1蛋白表达。结果空白对照组和阴性对照组Fgl2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),Fgl2-siRNA组Fgl2蛋白表达显著低于空白对照组(P<0.01);与空白对照组及阴性对照组比较,Fgl2-siRNA组H9C2细胞凋亡明显降低,酶切caspase3蛋白表达显著下调,Notch1、Hes1蛋白表达显著上调(P<0.01)。结论沉默Fgl2基因的表达可有效抑制H9C2心肌细胞凋亡,其机制与下调酶切caspase3蛋白表达、激活Notch1信号通路有关。

干扰miR-31表达初期Notch和Hedgehog信号通路相关基因在神经干细胞中的表达变化

目的:研究干扰miR-31表达初期Notch和Hedgehog信号通路相关基因在神经干细胞(NSCs)中的表达变化。方法:利用荧光定量PCR对干扰miR-31表达初期Notch和Hedgehog信号通路相关基因在NSCs中的表达变化进行研究。结果:干扰与过表达miR-31后3 d,NSCs中的Notch信号通路相关基因Notch2的表达均增加,Jag2、Dll3和Hes1等的表达均降低;Hedgehog信号通路相关基因Wnt3的表达均增加,Bmp5与Wnt7a的表达均降低。结论:影响miR-31的表达可引发NSCs发生分化,在此过程中Notch与Hedgehog信号通路中几个基因的表达都产生相应改变,表明miR-31与NSCs分化过程相关。

shRNA靶向干扰Notch2对人脑胶质瘤细胞株U251的影响

目的研究Notch2信号对人脑胶质瘤细胞株U251的增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法应用脂质体将pGFP-V-RSNotch2shRNA干扰质粒导入胶质瘤细胞株U251后,应用MTT法检测细胞增殖变化、流式细胞仪检测转染效率、细胞凋亡和细胞周期的改变、RT-PCR和Westenblot检测Notch2基因的抑制效果和干扰后细胞周期、凋亡相关蛋白的表达改变。结果 pGFP-V-RSNotch2shRNA干扰质粒转染效率为86.68%±2.54%,转染后在mRNA水平和蛋白水平均发生Notch2的表达抑制,与无关序列组和未转染组相比干扰组细胞自第5天开始增殖明显减慢(P<0.05),干扰组G0/G1期细胞百分数(68.2%±1.29%)显著高于无关序列组和未转染组(35.8%±2.37%和47.7%±1.03%,P<0.01),而干扰组G2/S期细胞(20.4%±1.56%)显著低于无关序列组和未转染组(49.1%±3.65%和35.4%±2.42%,P<0.05),干扰组凋亡率显著升高(P<0.05)。细胞周期、凋亡相关蛋白P21上调,cy-clinD1、p-Rb下调。结论 Notch2靶向干扰能够显著抑制U251细胞株的增殖、阻滞细胞周期、增加凋亡。

Notch4通过调控活化转录因子2影响胰腺癌细胞的迁移和侵袭及其可能的机制

目的:探讨Notch4调控活化转录因子2(activating transcription factor 2,ATF2)对胰腺癌(pancreatic cancer, PC)细胞侵袭和迁移的影响及其可能的机制。方法:收集台州学院附属医院2015年2月至2019年7月手术切除的PC组织及其配对的癌旁组织标本各60份,采用免疫组织化学技术检测Notch4的表达水平。采用siRNA技术敲减PC细胞系MiaPaCa-2和PANC-1中Notch4基因的表达,Transwell法分析Notch4敲减对细胞侵袭及迁移的影响,qPCR及Western blotting法检测Notch4敲减对细胞中Notch4和ATF2的mRNA及蛋白表达的影响。结果:与癌旁组织相比,Notch4在PC组织中的表达显著增加(P<0.01)。转染Notch4 siRNA后,MiaPaCa-2和PANC-1中Notch4和ATF2 mRNA及蛋白表达水平显著下降(均P<0.01)。与Control siRNA组比较,Notch4 siRNA组的PC细胞迁移和侵袭能力显著降低(均P<0.01)。结论:Notch4在PC组织中呈高表达,敲减Notch4可在转录水平下调ATF2的表达,进而抑制PC细胞的侵袭及迁移能力。