HLA新等位基因HLA-A*1127认定

目的发现和认定HLA新等位基因HLA-A*1127。方法应用PCR-SSO基因分型技术筛选可能的HLA新等位基因,采用分子克隆和PCR产物直接测序方法得到核苷酸序列,通过软件分析基因序列及其与最同源HLA等位基因序列的差异。结果发现1个样品的HLA-A位点结果异常。其序列与已知所有HLA-A等位基因序列不一致,与同源性最高的等位基因A*1104的差异是在第三外显子区域的570位碱基发生G→C的替换,并导致了相应的166密码子由GAG→GAC,编码的氨基酸由谷氨酸(Glu)变成天冬氨酸(Asp);571位碱基发生T→G的替换,并导致相应的167密码子由TGG→GGG,编码的氨基酸由色氨酸(Trp)变成甘氨酸(Gly)。结论该等位基因为HLA新的等位基因,被WHOHLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*1127。

KIR 3DL3基因cDNA分子克隆测序法鉴定1个常见型新等位基因

目的建立KIR3DL3基因c DNA分子克隆测序方法,鉴定在南方汉族人群中新发现的1个KIR3DL3等位基因。方法对1例KIR3DL3基因测序分型结果异常的标本,采集EDTA抗凝新鲜外周血样,提取mRNA,反转录成c DNA后,采用1对KIR3DL3基因特异性PCR引物对全部编码区序列做PCR扩增,扩增产物经切胶回收纯化后,做分子克隆和单体型测序。结果经分子克隆和测序,检出1个正常的KIR3DL3*01002等位基因和1个新变异的KIR3DL3等位基因,该新等位基因的序列与KIR3DL3*048最相近,但存在编码区(CDS)nt 1074 A>G同义突变,位于第8外显子的第337密码子由CAA变成CAG,其序列提交国际Gen Bank(序列号:KU529269)和IPD-KIR Database(IWS40002178),已被世界卫生组织(WHO)HLA因子命名委员会KIR分委会正式命名为KIR3DL3*04802,该新等位基因在306名南方汉族无关个体中共检出12次,检出频率为3.92%。结论成功建立KIR3DL3基因c DNA分子克隆测序方法,在等位基因水平的KIR研究中具有良好的应用前景。

KIR2DL1框架基因cDNA的分子克隆测序及一个新等位基因的鉴定

目的建立K工R2DLI框架基因cDNA的分子克隆测序方法，并鉴定南方汉族人群一个新的KIR2DL1等位基因。方法对-K豫2DL1框架基因测序分型结果异常的外周血样，提取mRNA，反转录为cDNA，用1对KIR2DLl框架基因特异性PCR引物进行扩增，特异性扩增产物（1．2kb）经切胶回收纯化后，进行分子克隆和单倍型测序。结果KIR2DL1特异性PCR扩增产物，经分子克隆和单倍型测序，检出1个正常的K／R2DL1＊00302等位基因和1个新变异的KIR2DL1等位基因。该新等位基因的序列与KIR2DL1＊00302最相近，但存在编码区nt 188A〉G点突变、位于第4外显子的第42密码子由GAG变成GGG，导致第42位氨基酸残基发生GIu42Gly改变；其序列提交GenBank（序列号：KP025960）和IPD-KIR数据库（IWS40001982），已被世界卫生组织HLA因子命名委员会KIR分委会正式命名为KIR2DL1＊031。结论我们建立了KIR2DL1框架基因cDNA分子克隆测序方法，在等位基因水平的KIR研究中具有广泛的应用前景。

南方汉族人群KIR2DL4基因的多态性及五个新等位基因的鉴定

目的研究南方汉族人群KIR2DL4基因的遗传多态性。方法采用自行设计的PCR引物对306名南方汉族无关个体K豫2DL4框架基因的8个外显子进行扩增，之后进行双向测序，用Assign3．5软件分析各样本的等位基因型。对与国际IPD-KIR数据库不完全匹配的样本进行cDNA分子克隆和单倍型测序。结果共检出11种KIR2DL4等位基因，其中KIR2DL4＊00503、＊00504、＊032、＊033、＊034被WHOHLA因子命名委员会KIR分委会正式命名为新等位基因。检出的等位基因及其频率分别为KIR2DL4＊00102（75．5％）、＊00103（8．2％）、＊00501（34．0％）、＊00503（0．7％）、＊00504（0．7％）、＊00602（14．4％）、＊00801（11．4％）、＊011（22．2％）、＊032（0．3％）、＊033（0．3％）和＊034（0．3％）。第7外显子CDSnt811位置正常的10A型等位基因（KIR2DL4＊00102、＊00103、＊00501、＊00503、＊00504、＊00602、＊032、＊033、＊034）和CDSnt811位置缺失腺嘌呤的9A型等位基因（K琥2DL4＊00801、＊011）的检出比例分别为97．0％及33．0％，约为2．9：1。结论获得了南方汉族人群KIR2DL4等位基因分子遗传多态性的基础数据，可为移植、生殖免疫、疾病关联研究及人类进化等提供参考。

中国南方汉族人群KIR2DS4基因的多态性

目的探讨南方汉族人群KIR2DS4分子遗传多态性。方法应用特异性PCR引物扩增306名无关个体KIR2DS4基因的全部外显子，确定KIR2DS4框架基因的有无。对存在KIR2DS4的样本，对该基因的全部外显子进行双向测序，用Assign3．5分析软件鉴定基因型。在测序分型中出现与国际IPD-KIR数据库不完全匹配结果的样本，进行cDNA分子克隆和单倍型测序。结果306名南方汉族无关个体中，携带KIR2DS4基因的个体为297例，经测序分型，均获得了清晰的序列峰图。共检出了7种等位基因，其中3个新等位基因被世界卫生组织HLA因子命名委员会KIR分委会正式命名。检出的等位基因及其频率分别为KIR2DS4＊00101（78．8％）、＊003（10．5％）、＊004（16．0％）、＊010（23．2％）、＊017（0．3％）、＊00105（0．3％）和＊018（0．7％），未检出KIR2DS4＊007等位基因。能正常表达于细胞表面的等位基因（KIR2DS4＊00101、＊017、＊00105）和不能正常表达于细胞表面的等位基因（KIR2DS4＊003、＊004、＊010、＊018）的检出比例分别为79．4％及50．4％，约为1．6：1。结论获得了南方汉族人群KIR2DS4等位基因分子遗传多态性，可为移植、疾病关联研究及人类进化等提供基础数据。

cDNA分子克隆法鉴定KIR3DL3*064新等位基因

目的:应用cDNA分子克隆测序方法,鉴定中国南方汉族1个KIR3DL3新等位基因。方法:采集1例KIR3DL3基因测序结果异常的无偿志愿捐血者的外周血样,提取mRNA并逆转录为cDNA。设计1对具有KIR3DL3基因特异性的PCR引物对cDNA进行扩增,扩增产物纯化后进行分子克隆测序。结果:经分子克隆测序,检出1个正常的KIR3DL3*00802等位基因和1个KIR3DL3*064新变异等位基因。KIR3DL3*064与KIR3DL3*00601等位基因的序列最为接近,仅有编码区存在nt1184 C>T错义变异,导致第9外显子中的第374密码子由ACT变为ATT,所编码的苏氨酸(Thr)变为异亮氨酸(Ile)。该等位基因被世界卫生组织HLA因子命名委员会KIR分委会正式命名为KIR3DL3*064。结论:cDNA分子克隆测序法能够鉴别常规测序分型中的异常结果,可用于鉴定KIR3DL3新等位基因。

新等位基因MICA＊065的鉴定及其序列分析

目的 鉴定中国深圳地区人群中新发现的1个主要组织相容复合物Ⅰ类相关基因A位点（MICA）等位基因,并对该新MICA基因的突变情况进行分析.方法 选择2012年1～12月,于深圳市血液中心行组织配型的供、患者中,1例MICA基因分型异常的健康供者作为研究对象.采用自主建立的基于聚合酶链反应-碱基序列直接测序（PCR-SBT）法对本例供者MICA基因第2～5外显子进行测序分型,利用分子克隆和单倍体测序的方法,鉴定出该个体MICA等位基因的序列.利用序列比对方法,对该MICA等位基因的突变情况进行分析.结果 于本例供者血液样品中,检出了1个新变异的MICA等位基因,其序列与MICA＊ 010∶01最为相近,但存在基因组DNA nt 637位点的碱基由胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T）,MICA基因第4外显子中的第1 91位密码子由CGC变异为TGC,导致氨基酸由精氨酸变异为半胱氨酸,该序列提交国际GenBank数据库（序列号：JN043370）和国际免疫遗传学信息系统/人类白细胞抗原（IMGT/HLA）数据库（序列号：HWS10013775）,已被命名为MICA＊ 065.结论 新等位基因MICA＊ 065的变异碱基T,是1个全新的随机突变位点,未在MICA其他等位基因中发现.