NOX1 siRNA对TNF-α诱导的A549细胞凋亡的影响

目的:探讨NOX1对TNF-α诱导的A549细胞凋亡的影响。方法:将A549细胞分为3组,空白组、TNF-α组和TNF-α+NOX1 siRNA组。TNF-α+NOX1 siRNA组细胞采用瞬时转染技术转染特异性NOX1 siRNA,转染12 h后用含TNF-α(10μg/L)的培养基继续培养;空白组和TNF-α组细胞分别用培养基和含TNF-α的培养基培养。48h后,采用Annexin V-FITC和PI双染法检测细胞凋亡率,DCFH荧光标记法检测细胞中ROS的表达量,Western blot法检测NOX1及p-JNK蛋白的表达水平。结果:与空白组相比,TNF-α组细胞凋亡率和ROS表达量升高(P<0.05),NOX1和p-JNK蛋白表达水平升高(P<0.05);与TNF-α组比较,TNF-α+NOX1 siRNA组细胞凋亡率和ROS表达量降低(P<0.05),细胞中NOX1和p-JNK蛋白表达水平也降低(P<0.05)。结论:NOX1可能通过增加ROS的表达,进而激活JNK/MAPK信号通路,引起A549细胞的凋亡。

A549细胞炎症氧化应激模型Nox1启动子差异结合蛋白的筛选

目的在炎症氧化应激细胞模型中筛选参与Nox1启动子活化的相关调控蛋白。方法 TNF-α刺激A549细胞建立炎症氧化应激细胞模型,运用DNApull-down技术筛选出Nox1启动子区结合蛋白,再用二维凝胶电泳技术分离pull-down后的结合蛋白,然后在2D凝胶上选取与对照组表达差异大于1.5倍的蛋白质点进行切胶,最后经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,筛选出Nox1启动子区差异结合蛋白。结果 2D凝胶上共筛选出1.5倍以上差异蛋白点7个,均为表达上调蛋白,鉴定出GLE1、DDX19A,KRT1、KRT1O四种蛋白质。结论 GLE1、DDX19A,KRT1、KRT10参与了TNF-α诱导的A549细胞Nox1活化的基因调控,为研究炎症氧化应激细胞模型的Nox1启动子区调控蛋白的生物学功能奠定了实验基础。

P38MAPK、Nox1及ROSmRNA在早发型重度子痫前期患者胎盘组织中的表达及意义

目的探讨Nox1、P38MAPK及ROS mRNA表达与早发型重度子痫前期发病的关系,揭示早发型重度子痫前期发病基础,为临床治疗提供理论依据。方法选择早发型重度子痫前期患者32例、晚发型重度子痫前期患者30例为研究组,35例正常分娩者为对照组。胎盘娩出后立即于脐带附着处母体面,避开钙化出血梗塞区(肉眼观)剪取大小为1 cm×1 cm×1 cm的组织两块,一份用无菌生理盐水(含0.1%DEPC水)漂洗,去除血液,置于经DEPC水处理并消毒的冻存管中,于-80℃冰箱保存待行RT-PCR检测;另一份取材后即以4%多聚甲醛固定,常规脱水,浸蜡,包埋,4um切片(每例5张),载玻片经清洁处理,APES包被,进行HE染色及脂肪特染观察胎盘组织的脂肪浸润情况和形态学改变;采用RT-PCR及免疫组化方法检测胎盘组织中Nox1、P38MAPK、ROSmPNA表达水平。结果各组胎盘组织的合体滋养细胞、血管内皮细胞、蜕膜细胞中均可以检测到Nox1、P38MAPKmRNA及ROS表达。早发型重度子痫前期组Nox1mRNA表达显著高于晚发型重度子痫前期组及对照组(0.712±0.012,0.215±0.013,0.113±0.01,p<0.01);早发型重度子痫前期组ROSmRNA水平显著高于晚发型重度前期组及对照组(142.43±11.81,96.12±8.93,102.21±9.75,p<0.01);早发型重度子痫前期组P38MAPKmRNA表达水平显著高于晚发型重度前期组及对照组(0.109±0.057,0.074±0.074,0.042±0.013,p<0.01)。各组胎盘组织中Nox1表达与ROS水平呈正相关(r=0.81,p<0.05);各组胎盘组织中Nox1表达与P38MAPKmRNA呈正关(r=0.63,p<0.01)。结论早发型重度子痫前期组胎盘中Nox1mRNA高表达与其发病及发展密切相关。P38MAPK介导的P38MAPK-Nox1-ROS脂质代谢途径可能在早发型重度子痫前期发生发展中起重要作用。

一氧化氮对拟南芥高硼毒害的缓解

硼是植物生长发育所必需的微量元素,当土壤中硼的含量过高时就会对植物的生长产生毒害,高硼胁迫能够抑制植物的生长,降低农作物的产量与品质,因此研究植物抗高硼胁迫的分子机制至关重要。一氧化氮(NO)作为信号分子参与植物的生长发育及多种胁迫反应过程。研究发现高硼胁迫能够诱导拟南芥内源NO含量的升高,外加NO能够提高拟南芥对高硼胁迫的抗性,同时内源NO含量升高的突变体nox1和cue1表现出抗高硼胁迫的表型,而内源NO含量低的突变体noa1则表现出高硼处理敏感的表型,为了进一步研究NO缓解高硼对拟南芥的毒害的机制,测定在不同处理条件下拟南芥中硼的含量变化。结果表明,随着培养基中硼酸含量的增加拟南芥中硼的含量也增加,而外源或者内源NO都能够降低高硼处理条件下拟南芥中硼的含量,降低对植物的毒害。因此,高硼胁迫下降低拟南芥体内硼的含量是NO缓解高硼毒害的重要方面。

Nox1基因启动子表达载体的构建

目的克隆烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Nox)上游启动子序列,为研究Nox1基因的转录调控奠定基础。方法以人基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得1415bp(-1415～0)、1276bp(-1415～-140)、997bp(-1415～-419)、839bp(-1415～-577)、470bp(-1415～-946)大小的Nox1启动子片段,将其定向克隆入pGL3-Basic荧光素酶表达载体,构建荧光素酶报告基因载体,进行真核细胞转染后鉴定目的片段启动子活性。结果在A549细胞中,各Nox1启动子片段均有活性;-140～-419bp和-577～-946bp区域可能存在Nox1启动子核心区域。结论成功克隆了在肺泡上皮样细胞中具有活性的Nox1启动子序列,为进一步研究Nox1基因的转录调控机制奠定了基础。