NP9基因的克隆及对细胞周期素D1转录活性的影响

背景与目的:NP9基因是我们在鼻咽癌中克隆到的一个新的表达下调的基因(GenBank登录号:BF718797),为了进一步研究该基因的功能,我们构建了人NP9基因编码区序列的真核表达质粒,并研究其表达对细胞周期素D1(cyclinD1)的影响。方法:通过核苷酸同源序列比较(BlastN)得到NP9EST的同源cDNA,RT-PCR扩增其编码区序列并构建真核表达重组质粒pRc/CMV2-NP9,脂质体转染后G418筛选出稳定、高效转录NP9基因的细胞克隆;再通过脂质体转染cyclinD1promoterLuc和NF-κB-Luc质粒到稳定表达NP9基因的细胞克隆,测定荧光素酶的活性以确定NP9基因对cyclinD1和NF-κB转录活性的影响;同时亚克隆NP9基因编码序列到载体pEGFP-C1中,脂质体转染细胞以确定NP9蛋白在细胞中的定位。结果:融合的绿色荧光蛋白出现于细胞核。G418抗性克隆中,RT-PCR扩增证实部分克隆表达NP9基因,且强弱不同。表达NP9基因的细胞克隆在瞬间转染cyclinD1promoterLuc和NF-κB-Luc48h后,荧光素酶的活性较其对照组分别下降46%和63%。结论:NP9蛋白在细胞核内表达;NP9基因通过抑制核转录因子NF-κB的转录活性下调cyclinD1的表达。

新的人内源性逆转录病毒NP9基因的分子克隆与病毒蛋白表达

目的:研究新近发现的人内源性逆转录病毒NP9基因与自身免疫性疾病的相关性及其可能的作用机制,构建该基因的蛋白表达系统。方法:提取自身免疫性疾病患者外周血单个核细胞(PBMCs)的总RNA,利用RT-PCR技术,扩增NP9基因,然后将该片段进行T-A克隆并测序鉴定,纯化回收后亚克隆于原核表达载体pQE30中,然后提取质粒,酶切鉴定;最后经IPTG诱导,原核表达重组子在M15宿主菌进行表达,并进行SDS-PAGE与Western印迹分析与鉴定。结果:应用RT-PCR技术,从系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的总RNA中扩增到一条大小约为250bp的片段,经T-A克隆与测序鉴定,证实此片段为NP9基因,具有一个完整的开放阅读框架;将pQE30-NP9重组子转化入宿主菌,用IPTG诱导菌体表达NP9重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western印迹技术鉴定证实:在相对分子量约9kD处见明显的病毒特异性的高表达条带。结论:已成功克隆了新的人内源性逆转录病毒NP9基因,并经IPTG诱导,在M15宿主菌中表达了相应的病毒蛋白,为进一步研究该逆转录病毒与自身免疫性疾病的相关性奠定基础。

雷公藤甲素通过抑制逆转录病毒HERV-K Np9基因转录诱导人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡

目的探讨雷公藤甲素诱导人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡分子机制。方法 MTT检测雷公藤甲素对Jurkat细胞的增殖抑制作用,然后用Origin Pro8计算出IC50。按照0、2、4、8、16 nmol/L浓度雷公藤甲素处理Jurkat细胞48 h,然后用流式细胞仪检测细胞凋亡变化。用半定量RT-PCR法检测加药处理后各组Np9基因m RNA的表达水平变化并用Kodak 1D 3.6软件对条带进行定量分析。采用统计软件分析Np9转录抑制与细胞凋亡的相关性。Western Blotting检测Np9下游信号分子c-myc,β-catenin,ERK,AKT和Notch1蛋白的变化。结果雷公藤甲素呈剂量依赖性抑制Jurkat细胞的增殖,其IC50为12.7 nmol/L。雷公藤甲素呈剂量依赖诱导Jurkat细胞凋亡。进一步实验研究结果显示,雷公藤甲素呈剂量依赖方式抑制Jurkat细胞中Np9基因的m RNA的转录水平。经统计分析发现Np9转录抑制与细胞凋亡之间具有显著的相关性(R2=0.907)。Western Blotting方法结果发现雷公藤甲素在抑制Np9 m RNA转录同时伴有其下游信号分子c-myc,β-catenin,ERK,AKT和Notch1蛋白表达水平降低。结论下调HERV-K Np9 m RNA及其下游信号分子c-myc,β-catenin,ERK,AKT和Notch1蛋白水平是雷公藤甲素诱导人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡的重要分子机制之一。

人NP9基因蛋白重组腺病毒的制备

目的:制备表达人NP9蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。方法:酶切pMD18TNP9质粒获得NP9基因编码区序列并克隆至穿梭载体构建重组pAdTrackCMVNP9载体,线性化后与pAdEasy1共转化BJ5183,通过同源重组得到重组的pADNP9病毒载体。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒。结果:酶切鉴定得到阳性pADNP9重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强。结论:成功构建了NP9基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒,为进一步研究NP9基因的功能及应用NP9进行基因治疗奠定基础。

NP9基因抑制鼻咽癌细胞成瘤的实验研究

目的确定NP9基因的表达对鼻咽癌细胞裸鼠成瘤的影响,并探讨其机制。方法构建NP9基因的真核表达载体,转染重组pR c/CMV2-NP9质粒于鼻咽癌细胞系CNE1和SUNE1,筛选并获得稳定表达NP9基因的细胞克隆CEN1/NP9和SUNE1/NP9。以裸鼠致瘤实验确定NP9基因对鼻咽癌细胞成瘤特性的影响;通过免疫组化检测移植瘤中增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期素D1(cyc lin D1)的表达。结果大部分转基因的G418抗性克隆能够检测到NP9基因的表达。CNE1/NP9细胞接种裸鼠后的成瘤率为43.8%,明显低于CNE1细胞(66.7%)和CNE1/空载体组(75.0%,P均<0.05)。SUNE1/NP9细胞接种裸鼠后移植瘤的生长速度减慢,第30天时肿瘤体积为(3.88±0.81)cm3,与SUNE1细胞和SUNE1/空载体组差异均有统计学意义(P均<0.05)。CNE1/NP9细胞的移植瘤显示出相对较低的PCNA和cyc lin D1表达水平。结论NP9基因通过下调PCNA和cyc linD1的表达,抑制鼻咽癌细胞的裸鼠成瘤或移植瘤的生长。