荞麦NRAMP基因家族鉴定及生物信息学分析

为研究荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)自然抗性相关巨噬细胞蛋白(NRAMP)家族成员结构与功能,借助生物信息学手段,从荞麦全基因组数据库中筛选并鉴定荞麦NRAMP家族基因序列,进而对该家族成员的蛋白质理化性质、基因结构、保守结构域、保守基序、亚细胞定位、磷酸化位点、系统进化关系、二级结构和三级结构进行分析。结果表明:在荞麦全基因组中共鉴定出10个NRAMP基因,命名为FeNRAMP1-FeNRAMP10,多数荞麦NRAMP家族成员蛋白质的氨基酸数介于361~605个,跨膜结构数4~12不等,且亚细胞定位除FeNRAMP10定位于液泡膜上外,其他均定位于细胞膜上。进化树分析结果表明,在进化上越接近于FeNRAMP,其基因结构和保守基序也更为相似。除FeNRAMP9蛋白不含有苏氨酸(Thr)磷酸化位点外,其余9个FeNRAMP蛋白的氨基酸序列均含有潜在的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)磷酸化位点,大部分荞麦NRAMP蛋白的二级结构形式主要是α-螺旋。启动子元件分析表明,多数荞麦NRAMP基因启动子含有参与基因转录、光响应、激素响应等元件。

苦荞NRAMP家族全基因组鉴定

天然抗性相关巨噬细胞蛋白(Natural Resistance Associated Macrophage Protein,NRAMP)是一个高度保守的膜蛋白家族,在植物体中广泛参与过渡金属离子的跨膜转运。本研究基于基因组学,从重要粮食作物苦荞(Fagopyrum tataricum)的基因组中鉴定出11个NRAMP基因,并通过TBtools、Cell-PLoc、MEGA、SWISS-MODEL、SOPMA等工具对该家族成员的理化性质、保守基序、基因结构、系统发育关系、三维结构、顺式作用元件等方面进行了系统分析。结果发现,苦荞NRAMP基因家族在相同亚族下的保守基序和基因结构高度一致。此外,苦荞NRAMP基因的启动子区域中含有大量植物激素响应元件及胁迫响应元件,亚族间的元件分布存在明显差异。对苦荞NRAMP基因编码蛋白的三维结构、亚细胞定位以及顺式作用元件分析发现,FtNRAMP4、FtNRAMP10、FtNRAMP11三个成员和其他FtNRAMP具有差异。苦荞NRAMP蛋白的二级结构以α-螺旋为主,占比为35.37%~63.00%。本研究结果为深入挖掘苦荞NRAMP基因家族功能提供了科学依据。

苎麻BnNramp2基因的克隆与生物信息学分析

重金属是主要的环境污染物之一,所有重金属对生物都有潜在的危害作用[1-6]。天然抗性相关巨噬细胞蛋白家族(Natural resistance-associated macrophage protein,NRAMP)是一类广泛存在于微生物、植物、动物中的古老且高度保守的膜整合蛋白家族,参与大多数有机体的金属离子(如Fe^2+、Cd^2+、Mn^2+、Zn^2+、Cu^2+、Ni^2+、Co^2+、Al^3+)的运输[7-9]。目前,已在许多高等植物中发现了NRAMP家族基因。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)基因组中,分别存在6和7个NRAMP家族成员,其中一些NRAMP基因的功能已经比较清楚。拟南芥中的Nramp1、Nramp3和Nramp4基因可以转运Mn、Fe和Cd[10-12],而Nramp6只能转运Cd[13]。在水稻中也有相关报道,Takahashi等研究发现OsNramp1基因与水稻根系对镉的吸收和转运过程密切相关,该基因在水稻根部表达量的差异也导致水稻品种间的镉积累量呈现差异[14]。Sasaki等将敲除了Nramp5基因的水稻突变体与野生型水稻植株同时种植在含锰和镉的培养基中,发现突变体根中锰和镉的含量及其净吸收量都显著低于野生型[15]。这些发现促进了对植物Nramp基因转运金属离子的研究,也表明Nramp基因在重金属抗性中起着重要作用。

猪Nramp1基因多态性与免疫功能的相关性

【目的】探讨Nramp1基因第6内含子多态在大白猪和松辽黑猪(是由杜洛克、长白猪和民猪合成)中的分布及其与猪免疫抗病的关系。【方法】采用PCR-RFLP法对165头大白猪和109头松辽黑猪Nramp1基因第6内含子多态性与免疫功能(中性粒细胞还原力和单核细胞细胞毒百分率)的相关性进行了研究。【结果】两个品种在该位点均存在多态性,品种间、合并基因型间免疫功能差异不大,但同一品种内不同基因型间差异显著;大白猪BB基因型个体的单核细胞细胞毒百分率显著高于AB基因型个体(P<0.05),BB基因型个体的中性粒细胞NBT还原力值极显著高于AB基因型个体(P<0.01),而在松辽黑猪中则是AB基因型个体的中性粒细胞NBT还原力值显著高于BB基因型个体(P<0.05);从断奶到出栏的死亡率分析显示大白猪BB基因型个体死亡率明显低于AB基因型个体,松辽黑猪则是AB基因型个体的死亡率明显低于BB基因型个体。【结论】品种内不同Nramp1基因型与免疫功能间存在着显著相关,Nramp1基因可作为抗病力性状的一个主要候选基因。

牛Nramp1基因启动子的克隆及其活性分析

【目的】牛Nramp1基因是主要的抗病候选基因,但其转录调控的分子机制尚不清楚。本研究欲确定牛Nramp1基因的启动子区域,找到启动子核心序列和主要的调控区,探索Nramp1基因表达机制。【方法】采用基因克隆、DNA测序、半定量RT-PCR和荧光素酶报告基因系统等技术手段,构建牛Nramp1基因5′侧翼区长片段及固定3′端的不同节段的pEGFP-N1和/或pGL3重组质粒,分别转染293T和RAW264.7细胞,并进行脂多糖(LPS)诱导,对不同片段的启动子活性进行定性和定量测定。【结果】牛Nramp1基因5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,+58—-89区域具有基本的启动子功能,+58—-1 748启动子活性最强。进一步研究表明,-89—-205 bp区域、-278—-1 495 bp区域存在着正调控元件,在-205—-278 bp区域内存在着负调控元件;另外,LPS能显著增强启动子活性,其诱导牛Nramp1基因的表达具有细胞特异性和剂量依赖性。【结论】成功构建了含推测的牛Nramp1基因启动子片段的重组报告基因载体,确定了启动子核心区域和主要的调控区域。

小金海棠抗缺铁相关基因——Nramp基因片段的克隆

以高效抗缺铁苹果种小金海棠 (MalusxiaojinensisChengetJiang)为试材 ,以异源的小麦Nramp基因为探针进行杂交分析。Southern杂交结果表明 :小金海棠基因组中存在该家族基因。Northern杂交结果表明 :在根和叶中 ,Nramp基因在正常供铁和缺铁胁迫下均能得以转录 ,且叶中的转录受缺铁胁迫的诱导而加强。通过PCR方法已从基因组DNA中扩增出了 75 2bp的特异性产物 ,该片段与水稻的Os Nramp3具有

沙棘NRAMP基因家族鉴定及铅胁迫下表达分析

【目的】NRAMP(natural resistance-associated macrophage protein)基因家族是一类广泛存在于植物中的天然抗性相关巨噬蛋白,对植物中二价金属离子的细胞转运具有关键作用。为挖掘沙棘NRAMP基因家族响应重金属铅胁迫的关键基因,阐明沙棘响应重金属铅胁迫的分子机制。【方法】利用生物信息学技术鉴定沙棘NRAMP家族成员,对编码该家族蛋白的理化性质、系统进化、基因结构、保守基序、顺式作用元件、不同浓度铅胁迫下的NRAMP基因表达谱、种内种间共线性、蛋白互作网络进行综合分析。【结果】NRAMP基因家族的11个成员不均匀分布于7个染色体上,被分为Group1-Group3三大类群。NRAMP基因家族成员的启动子具有丰富的激素应答、分生组织表达和环境应激响应元件。转录组分析表明,沙棘NRAMP基因家族的11个成员在不同浓度的铅离子胁迫下呈现差异表达,其中8个基因在1 000 mg/kg的铅胁迫下显著下调,7个基因在高浓度铅胁迫(5 000mg/kg)下表达上调,并对选定的6个沙棘NRAMP基因进行了RT-qPCR验证。沙棘与单子叶植物小麦NRAMP基因家族的种间共线性比率高于双子叶植物拟南芥。蛋白质互作网络分析表明,沙棘NRAMP基因家族成员HrLNRAMP8可能主要通过乙烯途径调控重金属的吸收转运。【结论】在全基因组范围内从沙棘中系统鉴定得到11个HrLNRAMP家族成员。Group2亚族成员基因结构最复杂且一致性较低;所有的沙棘NRAMP成员都含有NRAMP家族特有的转运基序motif1。不同基因家族成员在铅胁迫条件下的表达具有偏好性,该基因家族通过响应重金属铅离子胁迫来调控基因表达水平,从而降低重金属胁迫带来的伤害。

大豆Nramp基因家族的序列特征与亲缘关系分析

大豆基因组测序与注释为重要基因的发现和基因功能、进化和发生的研究提供了坚实基础。Nramp蛋白是古老的膜整合转运蛋白家族,在重金属抗性中起着重要的作用。本研究利用BLAST从大豆基因组搜索出8个编码Nramp蛋白的基因,GmNramp氨基酸序列非常保守,具有典型的Nramp结构域,预测的跨膜结构域10-11个。根据结构的差异,GmNramp蛋白分为两个亚家族。大豆GmNramp基因家族的扩张主要是由于染色体复制引起的,并且GmNramp在不同的组织或器官中可被转录,表明GmNramp在大豆生长发育过程具有一定的功能。研究结果为进一步分离大豆GmNramp基因奠定了基础。

荷斯坦牛Nramp1基因遗传多态性及其与乳房炎相关性的研究

利用PCR-SSCP技术检测了344头中国荷斯坦牛Nramp1基因exon 11的基因多态性,并分析了其不同基因型与乳房炎及产奶量性状的关系。结果表明:实验群体发现3种基因型AA、AB、BB,其中A等位基因为优势等位基因,等位基因频率为0.767,而B等位基因频率则为0.233。经X^2适合性检验,群体处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。测序结果显示:扩增片段分别在200 bp(C/G)和254 bp(T/G)存在碱基突变,并导致了氨基酸改变,分别为丙氨酸替换为脯氨酸(A1a356Pro)、亮氨基酸替换为蛋氨酸(Leu374Met)。通过构建最小二乘线性模型,进行Nramp1基因多态性与产奶量、体细胞评分(SCS)的相关性分析表明,AA型个体的SCS最小二乘均值显著低于BB、AB型(P<0.05),而AA型、AB个体的产奶量最小二乘均值显著高于BB型(P<0.01,P<0.05),AA基因型可作为乳房炎抗性的优良基因型。因此,可将Nramp1作为奶牛乳房炎候选基因应用于分子标记辅助选择育种。

合作猪Nramp1基因第六内含子多态性分析

采用PCR-SSCP方法检测了135头合作猪Nramp1基因第六内含子的多态性.结果表明:序列比对分析发现10个新的核苷酸多态位点,其中,转换7个,颠换2个,插入1个;试验群体发现5个基因型,即AA、AB、BB、CC、AC,其中B等位基因为优势等位基因,AB基因型为优势基因型;经χ2适合性检验,该群体处于Hardy-Wein-berg平衡状态(P>0.05);Nramp1基因遗传多态指数中,杂合度为0.617 4,多态信息含量为0.537 3,有效等位基因数为2.613 7.

香猪NRAMP1基因多态性与仔猪腹泻的研究

天然抗性巨噬蛋白1(natural resistance associated macrophage protein 1,NRAMP1)基因是与人、鼠的一些病原微生物(如分支杆菌中的沙门氏伤寒菌等)的易感性和抗性有关的重要候选基因。本研究利用PCR-RFLP技术,分析了香猪的NRAMP1基因第6内含子的NdeⅠ酶切位点的多态性;观测记录哺乳仔猪的腹泻情况,结果发现,NRAMP1基因的第6内含子的NdeⅠ酶切位点在各品种猪表现出丰富的多态性,该酶切位点的基因频率和基因型频率在各猪种中分布趋于一致,香猪不同品系基因型与腹泻指数统计分析结果显示,Ⅰ系、Ⅱ系差异不显著,11世代显著高于10世代。

NRAMP1基因3′UTR多态性与新疆哈萨克族结核病易感性的研究

为了研究人类自然抵抗相关巨噬细胞蛋白NRAMP1基因3′UTR多态性与新疆哈萨克族结核病易感性的关系,研究选取新疆哈萨克族活动性结核病患者213例,新疆哈萨克族正常对照者211人,用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法对NRAMP1基因3′UTR多态性进行基因分型,比较不同基因型及等位基因的频率,经统计学分析,探讨NRAMP1基因3′UTR多态性与新疆哈萨克族结核病易感性的关系.结果显示,在新疆哈萨克族活动性结核病患者组中NRAMP1基因3′UTR TGTG+/TGTG+基因型138例(64.8%),TGTG+/del基因型63例(29.6%),del/del基因型12例(5.6%);新疆哈萨克族正常对照组TGTG+/TGTG+基因型则为167例(79.1%),TGTG+/del基因型41例(19.5%),del/del基因型3例(1.4%).新疆哈萨克族结核病患者组TGTG+/del基因型和del/del基因型频率明显高于新疆哈萨克族正常对照组,差异有统计学意义(χ2=10.8,P<0.01);在新疆哈萨克族结核病患者组的TGTG+等位基因频率为79.6%,del等位基因频率为20.4%,新疆哈萨克族正常对照组中TGTG+和del等位基因频率分别为88.9%和11.1%,del等位基因在新疆哈萨克族结核病患者组中的分布频率高,差异有统计学意义(χ2=13.7,P<0.01).研究结果提示TGTG缺失等位基因可能是新疆哈萨克族结核病的易感基因,携带TGTG+/del和del/del基因型的新疆哈萨克族人群可能更易患结核病.

NRAMP1基因3’UTR多态性与结核病易感性的研究

目的 研究NRAMP1基因3’UTR多态性与汉族结核病易感性的关系。方法 选取汉族活动性结核病患者147例,正常对照145例,用PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restrictionfragment length polymorphisms)的方法对NRAMP1因基3’UTR进行基因分型,根据基因型对样本分组,经统计学处理,研究3’UTR多态性与结核病易感性的关系。结果 在活动性结核病患者中3’UTR TGTG/TGTG基因型95例(64.6％),TGTG/TGTG缺失基因型50例(34.0％),TGTG缺失/TGTG缺失基因型2例(1.4％),正常对照TGTG/TGTG基因型则为115 例(79.3％),TGTG/TGTG缺失基因型29例(20％),TGTG缺失/TGTG缺失基因型1例(0.7％)。正常对照组TGTG/TGTG基因型明显高于结核病患者(x2=7.79;P<0.01)。研究发现TGTG的等位基因频率为0.85,TGTG缺失的等位基因频率为O.15。结论 NRAMP1基因3’UTR多态性可能与结核病易感性相关,汉族3’UTRTGTG缺失等位基因频率明显高于白种人,可能部分解释汉族比白种人更易患结核病。

NRAMP1基因DNA多态性与海南黎族人结核病易感性的研究

目的探讨自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1(NRAMP1)基因D543N和3′UTR位点多态性与海南黎族人结核病易感性的关系。方法采用病例对照研究设计,共有130例肺结核病例和233例对照纳入本研究,用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法检测入选人群NRAMP1基因中D543N和3′UTR位点的多态性,并对结核病相关危险因素进行问卷调查,进行单因素和基因频率的分析。结果对所有研究对象进行D543N和3′UTR两个多态性位点的基因分型,3′UTR-TGTG+/TGTG-和3′UTR-TGTG-/TGTG-基因型病例组频率显著高于对照组,OR值分别为5.531(2.649-11.549)和0.181(0.087-0.378);D543N位点各基因型频率在病例和对照组中的频率无显著性差异;同时对4个相关危险因素进行了单因素分析,结果性别、酗酒两个因素在病例组和对照组中有显著性差异,OR值(95%CI)分别为3.937(2.459-6.304)和2.435(1.507-3.937),在多因素分析中,调整了性别、吸烟、酗酒3个因素后,3′UTR-TGTG+/TGTG-和3′UTR-TGTG-/TGTG-基因型仍与肺结核显著相关,OR值(95%CI)分别为5.140(2.394-11.034)和4.929(2.769-8.775)。结论NRAMP1基因3′UTR位点多态性可能是海南黎族人结核病的易感因素,D543N位点多态性与海南黎族人结核病的发生无关。

中国荷斯坦奶牛Nramp1基因多态性与泌乳性状及产奶量的关联性分析

为寻找与乳房炎相关的分子标记,为荷斯坦牛的抗病育种提供理论基础,试验采用PCR-SSCP技术和测序的方法对宁夏农垦303头中国荷斯坦奶牛的Nramp1基因进行了遗传多态性分析,利用一般线性模型分析Nramp1基因c.200C>G突变对泌乳性状及产奶量影响。结果显示,Nramp1基因c.200C>G突变与乳脂率、日产奶量和体细胞评分值存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)关联。因此,可以把该位点作为中国荷斯坦奶牛体细胞评分、测定日产奶量和日乳脂率的遗传标记进行进一步研究。

斗鸡Nramp1基因多态性与部分免疫指标相关性分析

随机选取同期孵化出雏的漳州斗鸡32只,测定12周龄鸡的部分免疫指标。利用PCR-SSCP技术检测斗鸡Nramp1基因第九外显子的多态性,并对不同基因型与免疫指标进行相关分析。结果显示:斗鸡Nramp1基因第九外显子在C315G、C357T处有2个突变,两处均为同义突变,并检测到3种基因型,不同基因型在异嗜性细胞与淋巴细胞比率(H/L值),Ig M和Ig M含量均呈现出显著差异(P<0.05)。AA基因型的H/L值、Ig G和Ig M含量均显著高于BB基因型,Ig M和Ig G含量与AB型差异显著(P<0.05),其余指标与AB基因型差异不显著。初步研究结果显示,斗鸡AA基因型的综合免疫性能要优于AB和BB型,可作为一种高抗性基因型。

徐州荷斯坦牛NRAMP1基因多态性与产奶量通径分析

采用PCR技术研究了徐州150头荷斯坦牛NRAMP1基因3′UTR非编码区域211 bp的DNA多态性,并对其与奶牛产奶量、乳房炎检出率、乳汁pH值等性状进行了相关及通径分析。结果表明,在这个区域出现了复杂的DNA多态性,有效等位基因数、固定指数、多态信息含量分别为20.488、-0.204 8和0.950,该群体处于Hardy-W e inberg平衡。基因型频率与奶牛产奶量呈正相关,且为直接作用;乳汁pH值与产奶量呈正相关,但间接作用较大;乳房炎检出率与奶牛产奶量呈正相关,直接发挥作用。

3个外种猪Nramp1基因多态性研究

采用PCR-RFLP方法,对3个外种猪群Nramp1基因第6内含子序列多态性进行了检测。结果表明,在3个外种猪群中均仅检测到AB和BB2种基因型,其中AB基因型为优势基因型,BB基因型为数极少,未检测到AA基因型。卡方检验结果表明,3个外种猪群该位点均处于遗传不平衡状态(P<0.01)。群体中该位点杂合度较高、纯合度较低,具有中度遗传多态性,可在后续的育种方案中实施分化选择和培育,为抗病育种提供遗传素材。

BCL10、Nramp1基因多态性与大白仔猪断奶前腹泻关联分析

为研究大白猪BCL10基因和Nramp1基因的单核苷酸多态性,并寻找与大白仔猪断奶前腹泻相关的分子标记,构建490头大白仔猪群体,对仔猪断奶前腹泻情况进行统计,利用PCR-RFLP法检测BCL10基因3′端1149T/C位点和Nramp1基因第六内含子NdeⅠ酶切位点多态性,同时与腹泻频率、腹泻指数和部分生长性状进行关联分析。结果显示:大白仔猪断奶前腹泻率为32.0%,重度腹泻个体的21日龄平均断奶重比正常个体低13.0%,日增重低16.2%,而且大白仔猪在7~11日龄和17~21日龄存在2个断奶前腹泻小高峰。仔猪腹泻粪便病原检测结果表明,22.5%的样本检出为沙门氏菌感染,17.5%的样本检出为致病性大肠杆菌感染。关联分析结果表明:BCL10基因多态性与初生重相关联(P<0.05),TT型个体初生重大于TC型个体,差异显著(P<0.05);BCL10基因多态性与腹泻频率、腹泻指数相关联,差异极显著(P<0.01),个体腹泻频率、腹泻指数均表现为TT>TC>CC,CC与TC之间差异显著(P<0.05),CC与TT之间差异极显著(P<0.01);Nramp1基因多态性与腹泻频率、腹泻指数相关联,差异极显著(P<0.01),个体腹泻频率、腹泻指数均为AA、AB型大于BB型,且AA型与BB型差异显著(P<0.05),AB型与BB型差异极显著(P<0.01)。研究结果表明,BCL10基因和Nramp1基因不同基因型对大白仔猪断奶前腹泻有显著影响,Nramp1基因与猪沙门氏菌感染导致的腹泻有关,BCL10基因3′端1149T/C位点和Nramp1基因第六内含子NdeⅠ酶切位点可以作为大白仔猪断奶前抗腹泻育种分子标记。