双路通脑方调节SIRT1/Nrf2/GPx4信号通路对缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡的影响

目的探讨双路通脑方对缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡的作用以及对沉默信息调节因子2同源物1(SIRT1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)信号通路的调节机制。方法采用随机数字表法选取20只大鼠作为假手术组,剩余70只大鼠均利用大脑中动脉闭塞法制备缺血性脑卒中大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、双路通脑方组、双路通脑方+SIRT1抑制剂组(双路通脑方+EX527组),每组20只。14 d后,对大鼠进行神经功能损伤评分;TTC染色检测大鼠脑梗死面积;HE染色检测大鼠脑组织病理变化;尼氏染色检测大鼠脑组织神经元数量;试剂盒检测大鼠脑组织中铁离子(Fe^(2+))、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的水平;免疫组化检测大鼠脑组织中酰基-辅酶a合成酶长链家族成员4(ACSL4)、转铁蛋白受体(TFR)、铁蛋白重链多肽1(FTH1)蛋白的阳性表达;Western blotting法检测大鼠脑组织中SIRT1、Nrf2、GPx4及胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(SLC7A11)蛋白的表达。结果与假手术组比较,模型对照组大鼠的神经功能缺损评分、脑梗死面积、Fe^(2+)和MDA含量、ACSL4、TFR蛋白表达升高(P<0.05),神经元数量、SOD和GSH含量、FTH1、SIRT1、Nrf2、GPx4及SLC7A11蛋白表达均降低(P<0.05);与模型对照组比较,双路通脑方组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积、Fe^(2+)和MDA含量、ACSL4、TFR蛋白表达降低(P<0.05),神经元数量、SOD和GSH含量、FTH1、SIRT1、Nrf2、GPx4及SLC7A11蛋白表达均升高(P<0.05);采用SIRT1抑制剂进行回补实验,结果显示SIRT1抑制剂逆转了双路通脑方对神经元铁死亡的抑制作用,同时也抑制了Nrf2和GPx4的表达(P<0.05)。结论双路通脑方可能通过激活SIRT1/Nrf2/GPx4信号通路来抑制缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡。

调控Nrf2/GPX4信号通路抑制铁死亡并缓解UUO小鼠肾纤维化

目的:评估单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型中调控核因子E2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路抑制铁死亡及肾脏纤维化的作用,检测慢性肾脏病(CKD)患者肾脏组织相关铁死亡及纤维化指标的表达情况。方法:收集9例CKD患者及9例非CKD患者肾穿标本石蜡切片,免疫组化法检测GPX4、Nrf2和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平。动物实验中,25只6~8周龄雄性C57BL/6小鼠采用简单随机抽样方法分为5组:假手术组、UUO模型组、UUO+liproxstatin-1(Lip-1;铁死亡抑制剂)组、UUO+萝卜硫素(SFN;Nrf2激动剂)组、UUO+厄贝沙坦(IRB)组,每组5只。正常饲料喂养1周,后3组分别腹腔注射Lip-1(10 mg·kg^(−1)·d^(−1))、SFN(25 mg·kg^(−1)·d^(−1))和IRB(20 mg·kg^(−1)·d^(−1))。取血清标本测定血清肌酐和尿素氮;肾脏组织石蜡包埋后行HE、Masson和Sirius red染色观察肾脏病理改变;Western blot、实时荧光定量PCR和免疫组化法检测小鼠肾脏组织Nrf2、GPX4、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、纤连蛋白(Fn)、I型胶原(Col-I)、α-SMA和NADPH氧化酶4(NOX4)的表达。结果:免疫组化结果显示,CKD患者肾脏组织石蜡切片GPX4和Nrf2表达低于非CKD患者,而α-SMA表达高于非CKD患者。动物实验中,与UUO组相比,3组用药组肾功能有改善,肾脏纤维化程度及相关指标表达减少;Lip-1和SFN用药组肾脏组织中Nrf2、GPX4和SLC7A11表达水平高于UUO组(P<0.05),NOX4表达水平低于UUO组(P<0.05)。结论:CKD患者及UUO小鼠肾脏纤维化及铁死亡显著增加;调控Nrf2/GPX4信号通路可抑制铁死亡并有效减轻UUO小鼠肾脏纤维化。

灵芝酸A通过激活Nrf2/GPX4信号通路减轻七氟烷诱导的HT22细胞铁死亡

目的研究灵芝酸A(ganoderic acid A,GAA)对七氟烷诱导的HT22细胞铁死亡的影响和机制。方法采用CCK-8法检测不同浓度GAA对HT22细胞的增殖活性,筛选出合适的GAA处理浓度。将HT22细胞分成对照组、七氟烷诱导组(Sev组)、GAA-25μmol/L组、GAA-50μmol/L组、GAA-100μmol/L组。对照组细胞按照常规方法处理;其他组均利用七氟烷进行诱导处理,同时不同浓度GAA组给予相应浓度的GAA干预。采用Western blot检测氧化应激相关因子(Nrf2、GPX4)与铁死亡相关因子(ACSL4、SLC7A11)的蛋白表达。利用相应的试剂盒检测Fe^(2+)、ROS、MDA、GSH、4-HNE等因子的含量。结果根据CCK-8实验结果,选择对HT22细胞增殖活性无影响的25、50、100μmol/L GAA进行后续研究。与对照组比较,Sev组的HT22细胞存活率降低(P<0.05),Nrf2、GPX4、ACSL4、SLC7A11蛋白表达减少(P<0.05),Fe^(2+)、ROS、MDA、4-HNE含量升高(P<0.05),GSH含量降低(P<0.05)。与Sev组比较,随着CAA处理浓度的升高,HT22细胞存活率显著升高(P<0.05),Nrf2、GPX4、ACSL4、SLC7A11蛋白表达增多(P<0.05),Fe^(2+)、ROS、MDA、4-HNE含量降低(P<0.05),GSH含量升高(P<0.05)。结论GAA通过激活Nrf2/GPX4信号通路减轻七氟烷诱导的HT22细胞铁死亡,从而发挥神经保护作用。GAA可作为治疗七氟烷麻醉神经损伤的潜在药物。

茯苓酸通过Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路调控铁死亡改善阿尔茨海默病大鼠认知障碍的研究

背景阿尔茨海默病(AD)是一种常见且不可逆转的神经退行性脑疾病,严重影响患者的生活品质和生存质量,目前仍缺乏有效的治疗方法延缓或阻止疾病进展。中药及其活性成分在防治AD方面具有重要潜力。目的探讨茯苓酸(PA)对AD大鼠认知障碍及核因子E2相关因子2(Nrf2)/溶质载体家族7A11(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路的影响。方法2022年1—9月将75只6~8周龄雄性SPF级SD大鼠依据随机数字表法分为对照组(Control组)、AD模型组(Model组)、PA治疗组(PA组),PA+Nrf2抑制剂组(PA+ML385组),除Control组外制备AD大鼠模型。造模成功后,PA组腹腔注射50 mg/kg PA,PA+ML385组腹腔注射50 mg/kg PA+30 mg/kg Nrf2抑制剂ML385,Control组与Model组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。末次给药24 h后进行Morris水迷宫实验,第2、4、6天进行定位航行实验,记录大鼠到达平台的时间(逃避潜伏期),第7天移走平台,记录大鼠在120 s内滞留平台时间和穿越平台次数。Nissl染色后观察各组大鼠海马神经元病理变化,普鲁士蓝染色检测海马组织铁沉积,免疫荧光染色检测海马神经元GPX4表达,检测海马组织谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、Fe2+含量,蛋白质印迹法(Western blotting)检测大鼠海马组织Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达。结果末次给药第2、4、6天Model组逃避潜伏期高于Control组、PA组,PA+ML385组高于PA组,差异有统计学意义(P<0.05);Model组平台停留时间、穿越平台次数低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05)。Nissl染色结果示Model组神经元坏死严重,细胞核皱缩,尼氏体数目减少;PA组神经元坏死减少,排列紧密且尼氏体增多;PA+ML385组神经元损伤明显加重,尼氏体数目减少。普鲁士蓝染色结果示Model组铁沉积较Control组增加,与Model组比较,PA组铁沉积减少,PA+ML385组较PA组铁沉积增多。免疫荧光染色结果示Model组绿色荧光减弱,GPX4阳性细胞减少,PA组细胞绿色荧光较Model组增强,GPX4阳性细胞增多,PA+ML385组较PA组GPX4阳性细胞减少。Model组GSH低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05);Model组MDA、Fe2+高于Control组、PA组,PA+ML385组高于PA组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Model组Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白相对表达量低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PA可改善AD大鼠认知障碍,其机制可能与通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡有关。

基于Nrf2/GPX4信号通路探讨半夏泻心汤诱导胃癌细胞铁死亡的机制

目的:观察半夏泻心汤(BXT)对人胃癌HGC-27、MKN-45、AGS细胞增殖的影响及其作用机制。方法:采用细胞增殖与活性检测法(CCK-8)检测不同浓度的BXT含药血清(5%、10%、20%)对HGC-27、MKN-45、AGS细胞增殖的影响;线粒体膜电位探针(TMRE)检测细胞内线粒体膜电位表达,采用试剂盒对铁离子(Fe^(2+))含量、脂质过氧化物(LPO)与超氧化物歧化酶(SOD)活性进行检测,采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测糖原合成激酶3β(GSK3β)、磷酸化GSK3β(p-GSK3β)、核转录因子E2相关因子2(Nrf2)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的蛋白表达水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、重链溶质载体家族3成员2(SLC3A2)、转铁蛋白受体3(TFRC)和肿瘤蛋白P53(TP53)mRNA表达。结果:CCK-8结果显示含药血清干预3种胃癌细胞24 h,与空白组比较,BXT组与卡培他滨组均可显著降低胃癌细胞存活率(P<0.01);含药血清干预胃癌细胞48 h,与空白组比较,卡培他滨组与BXT组均可明显降低3种胃癌细胞存活率,BXT组呈现剂量依赖,以20%效果最明显(P<0.01)。在铁死亡生化指标方面,与空白组比较,BXT组与卡培他滨组可以显著降低胃癌细胞中线粒体膜电位表达、SOD活性(P<0.01),显著提高LPO、Fe^(2+)的含量(P<0.01),从而提高胃癌细胞对铁死亡的敏感。在Nrf2/GPX4通路方面,与空白组比较,BXT组可以通过降低胃癌细胞中p-GSK3β、Nrf2、GPX4蛋白表达(P<0.01),提高SLC7A11、SLC3A2 mRNA表达(P<0.05),提高胃癌细胞中GSK3β的蛋白表达(P<0.01),提高TP53、TFRC mRNA表达(P<0.05,P<0.01),抑制Nrf2/GPX4通路诱导胃癌细胞发生铁死亡。与卡培他滨组比较,20%BXT组效果更为明显。结论:半夏泻心汤可以通过抑制Nrf2/GPX4通路的诱导胃癌细胞HGC-27、MKN-45、AGS发生铁死亡。

基于Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路探讨附芍地芩方抗结直肠癌作用机制

目的探讨附芍地芩方治疗结直肠癌的作用机制。方法体外细胞实验用附芍地芩方处理结直肠癌CT-26细胞,检测细胞增殖、迁移能力。流式细胞术检测结直肠癌CT-26细胞的活性氧(ROS)水平,并检测其铁离子(Fe^(2+))、丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性。PCR Array与Western blot方法分析验证铁死亡差异基因表达情况。体内动物实验将Balb/c小鼠随机分为空白对照组、模型组、奥沙利铂组(1.5 mg·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方低剂量组(4.49 g·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方中剂量组(8.97 g·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方高剂量组(17.94 g·kg^(-1)·d^(-1)),检测附芍地芩方对小鼠肿瘤组织Fe^(2+)、ROS、MDA水平,SOD活性及Nrf2、Keap1、SLC7A11、GPX4表达水平的影响。结果体外细胞实验显示,与空白对照组相比,附芍地芩方通过剂量依赖的方式显著抑制了结直肠癌CT-26细胞的增殖与迁移。附芍地芩方可以提高结直肠癌CT-26细胞中的Fe^(2+)(P<0.05)与ROS水平(P<0.01);提高结直肠癌CT-26细胞内MDA水平(P<0.01),并显著降低SOD活性(P<0.01)。铁死亡PCR Array分析发现,与空白对照组比较,附芍地芩方干预后,基因GPX4、SLC7A11表达显著下调,GSTA1、HMOX1、Ca9、Chac1、Keap1、Sqstm1、NOX1、FTH1、Tfr1、SAT2、Pparg、Hamp表达显著上调。Western blot实验检测发现,附芍地芩方干预后,结直肠癌CT-26细胞Keap1蛋白表达上调(P<0.01),Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达下调(P<0.01)。体内动物实验结果显示,附芍地芩方显著抑制小鼠皮下移植瘤的生长(P<0.05),肿瘤组织坏死程度增加,Fe^(2+)、ROS以及MDA水平增加(P<0.05,P<0.01),SOD活性下降(P<0.01),且肿瘤组织中Keap1蛋白表达上调(P<0.01),Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达下调(P<0.01)。结论附芍地芩方具有抗结直肠癌作用,并可能通过抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路促进结直肠癌细胞铁死亡以发挥抗结直肠癌作用。

苍术素调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对脑胶质瘤细胞铁死亡的影响

目的探讨苍术素调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对脑胶质瘤细胞铁死亡的影响及其机制。方法体外培养脑胶质瘤U251细胞,将U251细胞分为对照组、苍术素低剂量组(5 mol/L)、中剂量组(10 mol/L)、高剂量组(20 mol/L)、ML385组(Nrf2抑制剂1 mol/L)。MTT和Edu实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;试剂盒检测亚铁离子(Fe^(2+))、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)水平;Western blot检测Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达;建立脑胶质瘤裸鼠模型,观察肿瘤生长情况,检测肿瘤组织中Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白水平。结果细胞实验结果显示,与对照组比较,苍术素低、中、高剂量组U251细胞Fe^(2+)、MDA、LDH、ROS水平、细胞凋亡率、cleaved-caspase3水平显著性升高,GSH水平、OD490(24 h、48 h)值和细胞增殖率、Ki-67、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与苍术素高剂量组比较,ML385组U251细胞各检测指标水平无统计学差异(P>0.05);裸鼠成瘤实验结果表明,与模型组比较,苍术素组和ML385组裸鼠肿瘤质量和肿瘤体积、裸鼠肿瘤组织中Ki-67、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著性降低,cleaved-caspase3蛋白表达水平显著性升高(P<0.05);与苍术素组比较,ML385组裸鼠肿瘤质量、肿瘤体积、抑瘤率和各蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05)。结论苍术素可能通过抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路促进脑胶质瘤细胞铁死亡。

肺复方通过PI3K/Akt/Nrf2信号通路对A549/DDP细胞耐药性的影响

目的观察肺复方对人肺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞耐药性的作用及对PI3K/Akt/Nrf2信号通路的影响。方法选用A549/DDP细胞设立不含药血清的空白对照组、肺复方组、顺铂组、联合组,流式细胞术检测各组细胞周期分布和细胞中活性氧(ROS)的变化,Western blotting和RT-PCR检测PI3K/Akt/Nrf2信号通路及下游血红素氧合酶1(HO-1)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)的表达变化。结果与空白对照组、顺铂组相比,联合组引起细胞G1期阻滞,增加细胞内活性氧的累积,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与空白对照组比,肺复方组和联合组能减少Nrf2核转位,下调p-Akt、HO-1、NQO1、MRP1蛋白表达和mRNA表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论肺复方能够通过调控PI3K/Akt/Nrf2信号通路增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。

基于Nrf2-HO-1/GPX4信号轴探讨中药靛玉红衍生物E804抑制肺癌A549细胞增殖和迁移的作用机制

目的 探讨中药靛玉红衍生物E804对非小细胞肺癌(NSCLC)系A549细胞增殖和迁移的影响,并阐明Nrf2-HO-1/GPX4信号轴可能的作用机制。方法 以肺癌A549细胞为细胞模型。采用MTT和细胞划痕实验观察0、10μmol/L E804和10μmol/L E804+不同特异性抑制剂(Nec-1、CQ、Z-VAD、DFO、Fer-1和Lip-1)组细胞的增殖和迁移能力;采用DCFH-DA荧光探针法检测0、2.5、5和10μmol/LE804组细胞内活性氧(ROS)含量,比色法检测二价铁离子(Fe^(2+))含量,分光光度法检测还原型谷胱甘肽(GSH)含量,微量法检测丙二醛(MDA)含量;Western blot法检测0、2.5、5和10μmol/L E804组细胞SLC7A11、Transferrin、GPX4、SLC40A1、Nrf2和HO-1蛋白表达水平。结果 与对照组(0μmol/LE804)比较,2.5、5和10μmol/L E804升高细胞内ROS、Fe^(2+)和MDA水平,降低细胞内GSH含量(P<0.01),同时降低SLC7A11、GPX4、SLC40A1、Nrf2和HO-1蛋白表达水平(P<0.01),升高Transferrin表达水平(P<0.05)。与单独使用10μmol/LE804组比较,细胞凋亡抑制剂(Z-VAD)组和细胞铁死亡抑制剂(DFO、Fer-1和Lip-1)组能够部分逆转E804对A549细胞的增殖和迁移抑制(P<0.01)。结论 E804可抑制A549细胞增殖和迁移,并诱发铁死亡,其机制可能与抑制Nrf2-HO-1/GPX4信号轴有关。

疏肝补肾毓麟汤通过Keap1/Nrf2/GPX4通路抑制睾丸细胞铁死亡改善肝郁肾虚型少弱精子症小鼠的精子质量

目的探讨疏肝补肾毓麟汤改善肝郁肾虚型少弱精子症小鼠生精功能和精子质量的作用及其可能机制。方法60只雄性KM小鼠,随机分为空白组、模型组、疏肝补肾毓麟汤高、中、低剂量组和司他丁-1(Ferrostatin-1,Fer-1)组(Fer-1是铁死亡抑制剂)。除空白组外,其余组以1.25 g·kg^(-1)腺嘌呤灌胃(Intragastrical administration,ig.)+慢性束缚刺激构建肝郁肾虚型少弱精子症小鼠模型。给予相应药物干预后:精密天平称取小鼠体质量、睾丸质量、附睾质量计算睾丸指数、附睾指数;苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察睾丸组织病理变化并对睾丸生精功能进行评分;全自动精子分析仪检测精子密度和活动率;苯胺蓝染色法观察精子成熟度;布鲁斯蓝染色法观察睾丸组织铁沉积;免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)检测睾丸组织谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)、溶质载体家族7成员11(Recombinant Solute Carrier Family 7 Member 11,SLC7A11)蛋白表达;生化法检测睾丸组织超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量;蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测睾丸组织Kelch-样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)、核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、GPX4、SLC7A11蛋白表达。结果与空白组比较,模型组小鼠睾丸指数、附睾指数、睾丸生精功能、精子密度及活动率、精子成熟度均显著下降(P<0.05,P<0.01);经疏肝补肾毓麟汤及Fer-1干预后,上述指标均有显著改善(P<0.05,P<0.01),且睾丸组织铁沉积显著降低,Keap1表达显著降低,Nrf2、SLC7A11、GPX4表达显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论疏肝补肾毓麟汤能明显改善肝郁肾虚型少弱精子症,其机制可能与调控Keap1/Nrf2/GPX4信号通路抑制睾丸细胞铁死亡有关。

右美托咪定通过激活Nrf2/HO-1/GPX4通路抑制肾小管上皮细胞的铁死亡

目的 探讨右美托咪定(DEX)对Erastin诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)铁死亡的保护作用及其机制。方法 构建Erastin诱导的HK-2细胞铁死亡模型。将HK-2细胞分为对照组、Erastin模型组、Erastin+2.5μmol/L DEX组、Erastin+5μmol/L DEX组、Erastin+10μmol/L DEX组,采用CCK-8法检测细胞的存活率。将HK-2细胞分为对照组、Erastin模型组、Erastin+10μmol/L DEX组、Erastin+10μmol/L DEX+ML385(Nrf2抑制剂)组。采用CCK-8法检测细胞的存活率;使用细胞亚铁比色法测试盒检测细胞内Fe^(2+)水平的变化;应用流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)的含量;使用丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒检测细胞中MDA及GSH含量;Western blotting检测细胞中核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白的表达。结果 与对照组相比,Erastin组的细胞存活率显著被抑制(P<0.001),同时细胞中GSH含量降低(P<0.001),Fe^(2+)、ROS以及MDA含量升高(P<0.001);与Erastin组相比,Erastin+10μmol/L DEX组的细胞存活率明显升高(P<0.001),10μmol/L DEX显著升高细胞中GSH含量(P<0.001),显著降低Fe^(2+)、ROS以及MDA含量(P<0.001),并且显著上调细胞中Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的表达(P<0.001)。使用ML385后,Nrf2/HO-1/GPX4通路被抑制(P<0.001),细胞存活率降低(P<0.001),GSH含量降低(P<0.001),而Fe^(2+)、ROS以及MDA含量升高(P<0.05)。结论 DEX对Erastin诱导的HK-2细胞铁死亡具有保护作用,其机制可能是通过激活Nrf2/HO-1/GPX4通路实现抗氧化应激从而抑制铁死亡。

枸杞多糖调节Nrf2/HO-1/GPX4铁死亡途径对妊娠期糖尿病大鼠胰岛素抵抗的改善作用

目的 探讨枸杞多糖调节Nrf2/HO-1/GPX4铁死亡途径对妊娠期糖尿病(GDM)大鼠胰岛素抵抗的改善作用。方法 将SD成年大鼠雌雄合笼得到孕鼠,建立GDM模型,随机分为模型组,枸杞多糖低、中、高剂量组,ferrostatin-1组,每组8只,另设对照组,腹腔注射等剂量柠檬酸缓冲液。末次给药24 h后,检测大鼠FBG、FINS、IRI水平。再次复制GDM模型32只,随机分为模型组、枸杞多糖组、ML385组、枸杞多糖+ML385组,另设对照组。药物分组干预后,检测大鼠FBG、FINS、IRI、TG、TC水平,妊娠第19天检测母体及胎鼠体质量以及血清IL-18、IL-6、SOD、MDA水平,子宫内膜组织ACSL4、PTGS2、Nrf2/HO-1/GPX4通路蛋白表达。结果 与对照组比较,模型组大鼠FBG、FINS、IRI,母体及胎鼠体质量,血清TG、TC、IL-18、IL-6、MDA水平,子宫内膜组织ACSL4、PTGS2蛋白表达升高(P<0.05),血清SOD水平、子宫内膜组织Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表达降低(P<0.05);与枸杞多糖+ML385组比较,枸杞多糖组大鼠FBG、FINS、IRI,母体及胎鼠体质量,血清TG、TC、IL-18、IL-6、MDA水平,子宫内膜组织ACSL4、PTGS2蛋白表达降低(P<0.05),血清SOD、子宫内膜组织Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表达升高(P<0.05)。结论 枸杞多糖可通过促进Nrf2/HO-1/GPX4信号传导,抑制铁死亡途径,降低GDM大鼠血糖血脂水平,减弱其胰岛素抵抗。

基于Nrf2/ROS信号通路探讨岩藻多糖对食管癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨岩藻多糖对食管癌增殖的影响,并分析其机制。方法:MTT法分析细胞增殖抑制率,Hoechst 33258染色和流式细胞术检测细胞凋亡,DCFH-DA探针检测ROS水平,Western blot法分析Nrf2、HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax、caspase-3水平,研究岩藻多糖对细胞增殖以及Nrf2/ROS信号通路的影响。裸鼠成瘤实验验证岩藻多糖对瘤体的瘤重、瘤体积及Nrf2、HO-1、NQO-1水平的影响。结果:1~16µg/mL岩藻多糖极显著抑制ECA109细胞增殖,48 h IC50为3.26µg/mL。与对照组(0.1%DMSO)相比,1、2、4µg/mL岩藻多糖处理后的ECA109细胞出现核凝聚、染色质不规则收缩、凋亡小体等明显的凋亡特征,(极)显著促进ECA109细胞凋亡,极显著下调Bcl-2表达水平,极显著上调Bax、Cleaved-caspase-3表达水平,极显著增加ROS水平,极显著降低Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白水平(P<0.05,P<0.01);Nrf2过表达能显著下调岩藻多糖抑制ECA109细胞增殖效果,显著下调ROS水平,显著上调Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白水平(P<0.05)。体内实验显示,50、100 mg/kg岩藻多糖极显著抑制瘤体体积、瘤体质量,下调瘤体Nrf2、HO-1、NQO-1水平(P<0.05)。结论:岩藻多糖抑制ECA109细胞增殖,对体内移植瘤抑瘤效果显著,其机制与调控Nrf2/ROS信号通路有关。

金雀异黄酮通过Nrf2/HO-1信号通路减轻皮质神经元低氧/复氧损伤

目的研究金雀异黄酮(GEN)对皮质神经元低氧/复氧(H/R)损伤的影响,并基于核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1(Nrf2/HO-1)信号通路探讨其机制。方法分离并体外培养C57BL/6J小鼠胎鼠(妊娠15 d)皮质神经元,设正常对照(Normal)组、模型(H/R)组、GEN(12.5μmol·L^(-1))组、TBHQ(Nrf2激动剂,10μmol·L^(-1))组、GEN(12.5μmol·L^(-1))+TBHQ(10μmol·L^(-1))组。除正常对照组外,其他组采用低氧(5%CO_(2)+95%N_(2))4 h后复氧(5%CO_(2)+95%空气)24 h的方法制备H/R损伤皮质神经元模型,各组分别于造模前2h给药干预。采用CCK-8法、流式细胞术检测神经元活力和凋亡率,DCFH-DA荧光探针法检测神经元活性氧(ROS)含量,分光光度法检测神经元中丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)]活性,RT-PCR法检测神经元Nrf2、HO-1 mRNA表达,Western blot法检测神经元Nrf2、HO-1、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、激活型Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果与H/R组比较,GEN组、TBHQ组和GEN+TBHQ组皮质神经元活力明显升高、凋亡率明显降低(P<0.05);神经元中ROS、MDA含量明显降低,SOD、GSH-Px活性明显升高(P<0.05);Nrf2、HO-1 mRNA表达量明显升高(P<0.05);Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达量及Bcl-2/Bax比值明显升高,Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达量明显降低(P<0.05)。GEN+TBHQ组对H/R损伤皮质神经元活力、凋亡率、氧化应激指标、Nrf2/HO-1信号通路相关mRNA和蛋白表达的调控作用均明显优于GEN组和TBHQ组(P<0.05)。结论GEN可通过促进Nrf2/HO-1信号通路活化抑制氧化应激损伤和神经元凋亡,对皮质神经元H/R损伤起到保护作用。

α-亚麻酸植物甾醇酯调控Nrf2/GPX4信号通路抑制HepG2细胞铁死亡

目的探讨α-亚麻酸植物甾醇酯(PS-ALA)对油酸与铁死亡诱导剂(OA/erastin)联合诱导的HepG2细胞铁死亡的改善作用,并基于Nrf2/GPX4信号通路进一步探索其潜在分子机制。方法采用1mmol的OA和10μmol的erastin联合诱导HepG2细胞发生铁死亡,同时给予ALA、PS和PS-ALA干预。油红O染色观察HepG2细胞脂肪变性程度;Hoechst/PI双染评价铁死亡发生;蛋白免疫印迹检测铁死亡相关蛋白Nrf2、GPX4、HO-1、NQO1及ptgs2的表达水平;荧光探针检测细胞内ROS与脂质过氧化物水平。结果与Control组相比,OA/erastin组细胞内有大量脂质沉积,ROS和脂质过氧化物显著增多,发生明显铁死亡。PS-ALA干预显著减轻OA/erastin诱导的HepG2细胞脂质沉积、减少细胞ROS与脂质过氧化物产生,抑制铁死亡。进一步的分子机制研究表明PS-ALA显著上调HepG2细胞Nrf2及其靶基因GPX4、HO-1与NQO1的蛋白表达水平。结论PS-ALA能有效抑制OA/erastin诱导的HepG2细胞铁死亡,其分子机制可能与上调Nrf2/GPX4通路有关。

银杏素通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞铁死亡

[目的]探讨银杏素调节核因子E2相关因子2(Nrf2)/溶质载体家族7成员11(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管内皮细胞铁死亡的影响。[方法]将人脐静脉内皮细胞EA.hy926分为正常对照组(正常培养)、ox-LDL组(50 mg/L ox-LDL)、银杏素低剂量组(50 mg/L ox-LDL+10μmol/L银杏素)、银杏素中剂量组(50 mg/L ox-LDL+20μmol/L银杏素)、银杏素高剂量组(50 mg/L ox-LDL+40μmol/L银杏素)、ML385组(50 mg/L ox-LDL+40μmol/L银杏素+1μmol/L的Nrf2抑制剂ML385)、Erastin组(50 mg/L ox-LDL+40μmol/L银杏素+5μmol/L的SLC7A11抑制剂Erastin)、RSL3组(50 mg/L ox-LDL+40μmol/L银杏素+0.5μmol/L的GPX4抑制剂RSL3);MTT法检测细胞存活率;试剂盒检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)水平;特异性荧光探针法检测细胞内铁含量;DCFH-DA荧光探针法和氟硼二吡咯(BODIPYTM)法检测细胞内活性氧(ROS)和脂质ROS水平;Western blot检测细胞Nrf2、SLC7A11、GPX4、4-羟基壬烯酸(4-HNE)、环氧合酶2(COX2)、p53蛋白表达。[结果]与正常对照组相比,ox-LDL组细胞存活率、SOD含量、GSH含量以及Nrf2、SLC7A11、GPX4表达明显降低(P<0.05),MDA含量、细胞内Fe2+含量、细胞内ROS、脂质ROS以及4-HNE、COX2、p53表达显著升高(P<0.05)。与ox-LDL组相比,银杏素低、中、高剂量组细胞存活率、SOD含量、GSH含量及Nrf2、SLC7A11、GPX4表达明显升高(P<0.05),MDA含量、Fe2+含量、细胞内ROS、脂质ROS及4-HNE、COX2、p53表达显著降低(P<0.05)。与银杏素高剂量组相比,ML385组、Erastin组、RSL3组均减弱了银杏素对ox-LDL诱导的血管内皮细胞铁死亡的抑制作用。[结论]银杏素通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4通路抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞铁死亡。

Nrf2-GPX4信号通路与冠心病患者相关性研究

目的:通过检测血清Nrf2、GPX4活性水平,分析其与冠心病(coronary heart disease,CHD)以及冠脉病变严重程度的相关性,探讨其信号通路介导的铁死亡途径在CHD病情进展中的作用。方法:选取540例疑诊CHD患者,行冠状动脉造影检查,其中360例病人明确诊断为CHD,冠状动脉造影无异常180例为对照组(CON组)。通过ELISA检测CHD患者血清中Nrf2和GPX4活性水平,统计分析在有无CHD血清中Nrf2和GPX4活性差异,Western blot检测CON组和CHD组(各90例)外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCS)Nrf2蛋白的表达,分析其信号通路在CHD患者中的表达意义。结果:CHD组中Nrf2、GPX4活性水平均较对照组降低(P<0.05),且Westernblot检测两组患者PBMCs中Nrf2的表达水平:CHD组Nrf2(0.25±0.05)蛋白表达水平较CON组(0.87±0.16)是呈下调趋势(P<0.05),表明Nrf2蛋白表达水平在CHD患者是低表达的。Pearson相关性分析显示:血清Nrf2、GPX4水平与Gensini评分负相关(Nrf2:r=-0.347,P<0.001;GPX4:r=-0.423,P=0.001)。Nrf2、GPX4与TG负相关(Nrf2:r=-0.284,P<0.001;GPX4:r=-0.275,P=0.001),Nrf2和GPX4水平与LDL呈负相关(Nrf2:r=-0.418,P<0.05;GPX4:r=-0.426,P<0.05),Nrf2和GPX4水平与HDL呈正相关(Nrf2:r=0.318,P<0.05;GPX4:r=0.428,P<0.05),Nrf2与GPX4呈正相关(r=0.456,P<0.01)。结论:Nrf2-GPX4信号通路介导的铁死亡途径与冠脉病变程度及CHD的发病机制有着密切关系,且其作用机制可能与Nrf2-GPX4信号通路表达下调有关。

益气活血托毒方对慢性非细菌性前列腺炎大鼠Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响

目的观察益气活血托毒方对慢性非细菌性前列腺炎(CNP)大鼠Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响,探讨其治疗CNP作用机制。方法采用去势结合雌激素诱导法制备CNP大鼠模型。48只SD大鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组、塞来昔布组和益气活血托毒方组,每组12只。塞来昔布组予塞来昔布混悬液0.035 g/kg灌胃,益气活血托毒方组予益气活血托毒方水煎剂8.64 g/kg灌胃,空白组和模型组灌胃等体积生理盐水,连续28 d。Von Frey纤维丝测痛仪测定大鼠机械痛阈值,HE染色观察前列腺组织病理变化并进行病理评分,化学荧光法检测前列腺组织活性氧(ROS)含量,比色法测定前列腺组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量,Western blot检测前列腺组织Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠机械痛阈值、前列腺指数显著降低(P<0.01);前列腺组织腺腔大小不一,腔内分泌物消失,间质疏松、水肿,有大量纤维组织增生和炎性细胞浸润,病理评分显著升高(P<0.01);前列腺组织ROS、MDA含量显著升高,GSH-Px活性显著降低(P<0.01),Keap1、Nrf2蛋白表达显著降低,HO-1蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05)。与模型组比较,益气活血托毒方组大鼠机械痛阈值显著升高(P<0.01);前列腺组织轻微损伤,有少量纤维增生和炎性细胞浸润,病理评分显著降低(P<0.01,P<0.05);前列腺组织ROS、MDA含量显著降低,GSH-Px活性显著升高(P<0.01),Keap1、Nrf2蛋白表达显著升高,HO-1蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论益气活血托毒方可有效改善CNP大鼠前列腺组织病理形态,提高痛阈值,其作用机制可能与激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路,降低大鼠前列腺组织氧化应激损伤有关。

基于Keap1/Nrf2/HO-1信号通路研究当归醇提物对多囊卵巢综合征大鼠的保护作用

目的使用来曲唑联合高脂饮食建立多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)大鼠模型,探讨当归醇提物(ethanol extract of Angelicae Sinensis Radix,EEA)对PCOS大鼠的保护作用及其作用机制。方法来曲唑联合高脂饮食诱导雌性SD大鼠建立PCOS模型,并用EEA干预。阴道涂片染色、HE染色、酶联免疫吸附法(ELISA)和生化指标检测评价EEA对PCOS大鼠的治疗作用,并通过荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测EEA对Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响。结果阴道涂片和HE染色结果表明,EEA改善了PCOS大鼠动情周期紊乱和卵巢组织病变,ELISA和生化指标检测结果表明EEA可以调节激素紊乱,改善血脂异常;且在模型组中Keap1蛋白和mRNA表达明显上调,Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表达明显下调而经过EEA治疗后Keap1蛋白和mRNA表达明显下调,Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表达明显上调(P<0.05或P<0.01)。结论EEA可以减轻大鼠PCOS,其机制可能是通过促进Keap1/Nrf2/HO-1信号通路,从而抑制氧化应激。

葛根芩连汤对2型糖尿病db/db小鼠胰腺组织PERK/ATF4/CHOP信号通路的影响

目的观察葛根芩连汤对2型糖尿病(T2DM)小鼠胰腺内质网应激的影响,探讨其治疗T2DM的作用机制。方法75只SPF级雄性db/db小鼠随机分为模型组、二甲双胍组和葛根芩连汤高、中、低剂量组,每组15只,15只db/m小鼠作为空白组,给药组分别予相应药物灌胃12周。检测小鼠体质量、空腹血糖(FBG)及糖化血红蛋白(HbA1c),HE染色观察胰腺组织病理变化,TUNEL染色检测胰岛细胞凋亡情况,Western blot检测胰腺组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、p-PERK、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白表达,实时荧光定量PCR检测胰腺组织PERK、ATF4、CHOP mRNA表达。结果与空白组比较,模型组小鼠体质量、FBG和HbA1c含量显著增加(P<0.01);胰腺组织结构不完整,边界模糊,内有空泡,胰岛细胞凋亡明显增加(P<0.01);胰腺组织GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP蛋白表达显著升高(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP mRNA表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,各给药组小鼠体质量、FBG和HbA1c含量显著减少(P<0.05,P<0.01);胰腺组织病理改变有所减轻,胰岛细胞凋亡不同程度减少(P<0.05,P<0.01);葛根芩连汤高、中剂量组和二甲双胍组胰腺组织GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP蛋白表达显著降低(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP mRNA表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论葛根芩连汤可能通过抑制内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路,下调相关基因和蛋白表达,减少胰岛细胞凋亡,保护胰岛细胞功能,延缓T2DM进展。