基于Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路探讨附芍地芩方抗结直肠癌作用机制

目的探讨附芍地芩方治疗结直肠癌的作用机制。方法体外细胞实验用附芍地芩方处理结直肠癌CT-26细胞,检测细胞增殖、迁移能力。流式细胞术检测结直肠癌CT-26细胞的活性氧(ROS)水平,并检测其铁离子(Fe^(2+))、丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性。PCR Array与Western blot方法分析验证铁死亡差异基因表达情况。体内动物实验将Balb/c小鼠随机分为空白对照组、模型组、奥沙利铂组(1.5 mg·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方低剂量组(4.49 g·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方中剂量组(8.97 g·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方高剂量组(17.94 g·kg^(-1)·d^(-1)),检测附芍地芩方对小鼠肿瘤组织Fe^(2+)、ROS、MDA水平,SOD活性及Nrf2、Keap1、SLC7A11、GPX4表达水平的影响。结果体外细胞实验显示,与空白对照组相比,附芍地芩方通过剂量依赖的方式显著抑制了结直肠癌CT-26细胞的增殖与迁移。附芍地芩方可以提高结直肠癌CT-26细胞中的Fe^(2+)(P<0.05)与ROS水平(P<0.01);提高结直肠癌CT-26细胞内MDA水平(P<0.01),并显著降低SOD活性(P<0.01)。铁死亡PCR Array分析发现,与空白对照组比较,附芍地芩方干预后,基因GPX4、SLC7A11表达显著下调,GSTA1、HMOX1、Ca9、Chac1、Keap1、Sqstm1、NOX1、FTH1、Tfr1、SAT2、Pparg、Hamp表达显著上调。Western blot实验检测发现,附芍地芩方干预后,结直肠癌CT-26细胞Keap1蛋白表达上调(P<0.01),Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达下调(P<0.01)。体内动物实验结果显示,附芍地芩方显著抑制小鼠皮下移植瘤的生长(P<0.05),肿瘤组织坏死程度增加,Fe^(2+)、ROS以及MDA水平增加(P<0.05,P<0.01),SOD活性下降(P<0.01),且肿瘤组织中Keap1蛋白表达上调(P<0.01),Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达下调(P<0.01)。结论附芍地芩方具有抗结直肠癌作用,并可能通过抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路促进结直肠癌细胞铁死亡以发挥抗结直肠癌作用。

基于ROCK/NOX4信号通路探究刺芒柄花素对2型糖尿病大鼠内质网应激损伤及肾功能的影响

目的基于RAS同源基因家族成员相关激酶(ROCK)/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)4信号通路探究刺芒柄花素对2型糖尿病大鼠内质网应激损伤及肾功能的影响。方法SPF级健康8周龄雄性C57BL/6大鼠60只,随机分为5组,各12只,健康组、模型组、刺芒柄花素低、中、高组,除健康组外均建立2型糖尿病大鼠模型,刺芒柄花素低组、刺芒柄花素中组、刺芒柄花素高组分别给予20、40、100 mg/kg刺芒柄花素灌胃,其余组别灌胃等体积生理盐水。采用自动生化分析仪测定肾功能指标。苏木素-伊红(HE)染色与Masson染色观察大鼠肾组织病形态。TUNEL检测肾小管上皮细胞凋亡。免疫组化检测RAS同源基因家族成员(Rho)A、NOX4、ROCK阳性表达。Western印迹检测内质网应激相关蛋白表达。结果HE染色结果显示:健康组肾脏组织结构正常;模型组肾小球有一定程度萎缩,组织结构排列不均匀,并且有肿胀、脱落现象、还存在空泡样变性、鲍曼囊腔扩,而经过刺芒柄花素干预后,上述情况有所改善,且呈现出明显的剂量依赖性。Masson染色结果显示:健康组肾组织正常;模型组肾小球、肾小管基底膜增厚,产生空泡样病变,肾间质胶原纤维沉积明显;在经过刺芒柄花素干预后上述状况明显改善,且呈现出明显的剂量依赖性。健康组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著低于模型组(P<0.05)。模型组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著高于刺芒柄花素低组(P<0.05)。刺芒柄花素低组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著高于刺芒柄花素中组(P<0.05)。刺芒柄花素中组24 h MAU、SCr、BUN、细胞凋亡率、RhoA、NOX4、ROCL、eIF2α、GRP78水平显著高于刺芒柄花素高组(P<0.05)。结论刺芒柄花素可能是通过调控Rho/ROCK/NOX4信号通路抑制了2型糖尿病大鼠内质网应激,改善肾功能,对肾脏起保护作用。

苍术素调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对脑胶质瘤细胞铁死亡的影响

目的探讨苍术素调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对脑胶质瘤细胞铁死亡的影响及其机制。方法体外培养脑胶质瘤U251细胞,将U251细胞分为对照组、苍术素低剂量组(5 mol/L)、中剂量组(10 mol/L)、高剂量组(20 mol/L)、ML385组(Nrf2抑制剂1 mol/L)。MTT和Edu实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;试剂盒检测亚铁离子(Fe^(2+))、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)水平;Western blot检测Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达;建立脑胶质瘤裸鼠模型,观察肿瘤生长情况,检测肿瘤组织中Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白水平。结果细胞实验结果显示,与对照组比较,苍术素低、中、高剂量组U251细胞Fe^(2+)、MDA、LDH、ROS水平、细胞凋亡率、cleaved-caspase3水平显著性升高,GSH水平、OD490(24 h、48 h)值和细胞增殖率、Ki-67、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与苍术素高剂量组比较,ML385组U251细胞各检测指标水平无统计学差异(P>0.05);裸鼠成瘤实验结果表明,与模型组比较,苍术素组和ML385组裸鼠肿瘤质量和肿瘤体积、裸鼠肿瘤组织中Ki-67、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著性降低,cleaved-caspase3蛋白表达水平显著性升高(P<0.05);与苍术素组比较,ML385组裸鼠肿瘤质量、肿瘤体积、抑瘤率和各蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05)。结论苍术素可能通过抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路促进脑胶质瘤细胞铁死亡。

丹参酮ⅡA激活Nrf2/Nox4通路减轻脂多糖诱导的小鼠肺炎和纤维化

目的研究丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)对脂多糖诱导小鼠肺炎和纤维化影响,探讨其潜在的作用机制。方法30只8周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分成对照组、脂多糖(LPS)组和LPS+Tan ⅡA组。采用尾静脉注射LPS制作小鼠肺炎和纤维化动物模型,术后给予Tan ⅡA干预,每日一次,连续2周,实验第4周处死所有小鼠,收集血清和肺组织标本。采用HE染色检测肺组织炎症改变,Masson染色观察肺组织纤维化程度,ELISA检测血清IL-1β、TNF-α和IL-10蛋白表达,采用Western blot技术检测肺组织Nrf2、Nox4、Nqo1和Ho-1蛋白表达。结果与对照组相比,LPS组小鼠肺脏重量、肺脏/体重比显著增加,肺组织水肿、炎细胞浸润和纤维化明显加重,血清促炎蛋白IL-1β、TNF-α显著升高,抑炎蛋白IL-10表达下降(P<0.05)。Tan ⅡA处理显著减轻LPS导致的小鼠肺脏重量、肺脏/体重比,减轻肺水肿、炎细胞浸润和纤维化,减低血清IL-1β、TNF-α表达水平,升高IL-10表达水平。此外,Nrf2和Nox4蛋白表达水平LPS组高于对照组,Nqo1和Ho-1蛋白表达水平低于对照组,而Tan ⅡA处理可以上调Nrf2、Nqo1和Ho-1蛋白,降低Nox4蛋白表达水平(P<0.05)。结论Tan ⅡA减轻LPS诱发的小鼠炎症和纤维化,与激活Nrf2/Nox4通路相关。

苦参碱通过上调KLF4/Nrf2通路减轻H_(2)O_(2)诱导的人脐静脉内皮细胞氧化损伤

目的:基于KLF4/Nrf2途径探讨苦参碱对过氧化氢(hydrogen peroxide,H_(2)O_(2))诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)氧化损伤的作用及机制。方法:培养HUVECs,采用CCK-8方法筛选苦参碱实验浓度。将HUVECs分为对照组、模型组和低、中、高浓度(0.5、1和2 mmol/L)苦参碱组,以H_(2)O_(2)(0.5 mmol/L)诱导建立HUVECs氧化损伤模型,检测细胞活力、细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和谷胱甘肽过氧化物酶(gluta-thione peroxidase,GPX)活性;RT-qPCR和Western blot方法检测细胞中Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)、醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1,NQO1)及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl cysteine synthetase,γ-GCS)的mRNA和蛋白表达水平。进一步采用siRNA技术敲减KLF4基因表达,与苦参碱共同作用,观察上述指标的变化。结果:与模型组比较,苦参碱组细胞活力上升(P<0.05),ROS水平和MDA含量降低(P<0.05),SOD和GPX活性上升(P<0.05),KLF4、Nrf2、HO-1、NOQ1及γ-GCS表达水平升高(P<0.05)。抑制KLF4的表达后,苦参碱逆转H_(2)O_(2)引起的细胞活力降低、ROS升高及抗氧化应激分子表达的作用均显著减弱(P<0.05)。结论:苦参碱能够通过激活KLF4/Nrf2通路、抑制氧化应激来减轻H_(2)O_(2)诱导的HUVECs氧化损伤。

姜黄素通过激活Nrf2/Nox4通路调控压力负荷诱导的心力衰竭

目的探讨姜黄素(CUR)对小鼠压力负荷性心力衰竭(HF)的保护作用及可能机制。方法 30只健康雄性C57BL/6小鼠随机分成假手术组(Sham)、心力衰竭组(HF)和姜黄素治疗组(HF+CUR)。通过主动脉弓缩窄(TAC)建立小鼠压力负荷性心力衰竭模型。实验第4周,收集各组小鼠心肌组织,称取心脏重量,计算心脏重量指数;HE染色观察心脏组织病理学改变;Western blot检测MDA5,IRE-a I、SOD-1、Nrf2和Nox4蛋白的表达。结果 HF组小鼠心脏重量和心脏重量指数显著增加,心肌间质出现明显的炎症细胞浸润,促氧化应激蛋白MDA5和IRE-a I表达升高,而SOD-1蛋白表达降低。CUR处理显著降低小鼠心脏重量和心脏重量指数,减少心肌间质炎症细胞浸润,降低MDA5和IRE-a I蛋白表达,提高SOD-1蛋白表达。此外,CUR处理还能显著增加Nrf2蛋白表达,降低Nox4蛋白表达。结论 CUR处理对小鼠压力负荷性HF有保护作用,其潜在机制可能与激活Nrf2/Nox4信号通路相关。

银杏素通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞铁死亡

[目的]探讨银杏素调节核因子E2相关因子2(Nrf2)/溶质载体家族7成员11(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管内皮细胞铁死亡的影响。[方法]将人脐静脉内皮细胞EA.hy926分为正常对照组(正常培养)、ox-LDL组(50 mg/L ox-LDL)、银杏素低剂量组(50 mg/L ox-LDL+10μmol/L银杏素)、银杏素中剂量组(50 mg/L ox-LDL+20μmol/L银杏素)、银杏素高剂量组(50 mg/L ox-LDL+40μmol/L银杏素)、ML385组(50 mg/L ox-LDL+40μmol/L银杏素+1μmol/L的Nrf2抑制剂ML385)、Erastin组(50 mg/L ox-LDL+40μmol/L银杏素+5μmol/L的SLC7A11抑制剂Erastin)、RSL3组(50 mg/L ox-LDL+40μmol/L银杏素+0.5μmol/L的GPX4抑制剂RSL3);MTT法检测细胞存活率;试剂盒检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)水平;特异性荧光探针法检测细胞内铁含量;DCFH-DA荧光探针法和氟硼二吡咯(BODIPYTM)法检测细胞内活性氧(ROS)和脂质ROS水平;Western blot检测细胞Nrf2、SLC7A11、GPX4、4-羟基壬烯酸(4-HNE)、环氧合酶2(COX2)、p53蛋白表达。[结果]与正常对照组相比,ox-LDL组细胞存活率、SOD含量、GSH含量以及Nrf2、SLC7A11、GPX4表达明显降低(P<0.05),MDA含量、细胞内Fe2+含量、细胞内ROS、脂质ROS以及4-HNE、COX2、p53表达显著升高(P<0.05)。与ox-LDL组相比,银杏素低、中、高剂量组细胞存活率、SOD含量、GSH含量及Nrf2、SLC7A11、GPX4表达明显升高(P<0.05),MDA含量、Fe2+含量、细胞内ROS、脂质ROS及4-HNE、COX2、p53表达显著降低(P<0.05)。与银杏素高剂量组相比,ML385组、Erastin组、RSL3组均减弱了银杏素对ox-LDL诱导的血管内皮细胞铁死亡的抑制作用。[结论]银杏素通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4通路抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞铁死亡。

4⁃辛基衣康酸通过Keap1/Nrf2/GPX4通路减少癫痫大鼠海马神经元铁死亡

目的:探讨4⁃辛基衣康酸(4⁃OI)对癫痫大鼠海马神经元铁死亡的影响。方法:雄性SD大鼠45只,随机分为生理盐水组、戊四氮组(PTZ)和4⁃辛基衣康酸和戊四氮联合治疗组(4⁃OI+PTZ)。观察记录各组大鼠癫痫发作程度行为学及脑电图变化,应用尼氏染色观察海马区神经元变化,膜片钳技术评估海马CA1区的神经元兴奋性,试剂盒测定海马区铁离子、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)水平,采用免疫组化与Western Blot检测各组大鼠海马区神经元核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)、Klech样ECH关联蛋白1(Keap1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)的表达情况。结果:与生理盐水组比较,PTZ组癫痫样发作明显,神经元尼氏体的含量显著减少,神经元的兴奋性显著增加,海马区铁离子、MDA、PTGS2与Keap1的表达明显升高,GSH、Nrf2、GPX4的表达明显下降(P<0.05);与癫痫组相比,4⁃OI处理组癫痫发作等级降低,神经元尼氏体的含量显著增加,神经元的兴奋性显著下降,海马区铁离子、MDA、PTGS2与Keap1的表达明显下降,GSH、Nrf2与GPX4的表达明显升高(P<0.05)。结论:4⁃OI可以通过抑制癫痫模型大鼠海马组织中Keap1的活性,进而上调Nrf2和GPX4表达,抑制神经元铁死亡并缓解癫痫发作。

调控Nrf2/GPX4信号通路抑制铁死亡并缓解UUO小鼠肾纤维化

目的:评估单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型中调控核因子E2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路抑制铁死亡及肾脏纤维化的作用,检测慢性肾脏病(CKD)患者肾脏组织相关铁死亡及纤维化指标的表达情况。方法:收集9例CKD患者及9例非CKD患者肾穿标本石蜡切片,免疫组化法检测GPX4、Nrf2和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平。动物实验中,25只6~8周龄雄性C57BL/6小鼠采用简单随机抽样方法分为5组:假手术组、UUO模型组、UUO+liproxstatin-1(Lip-1;铁死亡抑制剂)组、UUO+萝卜硫素(SFN;Nrf2激动剂)组、UUO+厄贝沙坦(IRB)组,每组5只。正常饲料喂养1周,后3组分别腹腔注射Lip-1(10 mg·kg^(−1)·d^(−1))、SFN(25 mg·kg^(−1)·d^(−1))和IRB(20 mg·kg^(−1)·d^(−1))。取血清标本测定血清肌酐和尿素氮;肾脏组织石蜡包埋后行HE、Masson和Sirius red染色观察肾脏病理改变;Western blot、实时荧光定量PCR和免疫组化法检测小鼠肾脏组织Nrf2、GPX4、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、纤连蛋白(Fn)、I型胶原(Col-I)、α-SMA和NADPH氧化酶4(NOX4)的表达。结果:免疫组化结果显示,CKD患者肾脏组织石蜡切片GPX4和Nrf2表达低于非CKD患者,而α-SMA表达高于非CKD患者。动物实验中,与UUO组相比,3组用药组肾功能有改善,肾脏纤维化程度及相关指标表达减少;Lip-1和SFN用药组肾脏组织中Nrf2、GPX4和SLC7A11表达水平高于UUO组(P<0.05),NOX4表达水平低于UUO组(P<0.05)。结论:CKD患者及UUO小鼠肾脏纤维化及铁死亡显著增加;调控Nrf2/GPX4信号通路可抑制铁死亡并有效减轻UUO小鼠肾脏纤维化。

布洛芬对缺血性脑中风大鼠的神经保护作用及对Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路的影响

目的 探讨布洛芬调节核因子E2相关因子2(Nrf2)/非糖基化的x CT(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路对缺血性脑中风(IS)大鼠神经保护的作用。方法 48只以大脑中动脉梗死模型复制IS大鼠,将IS大鼠随机分为IS组、治疗组(30 mg/kg布洛芬)、抑制剂组(30 mg/kg ML385)、治疗+抑制剂组(30 mg/kg布洛芬+30 mg/kg ML385),其中以仅分离血管但不结扎的12只大鼠作为假手术组。干预结束后,对大鼠进行神经功能评分,检测大鼠脑梗死率以及脑水肿含量;取出大鼠脑组织,观察神经元形态学变化、检测铁离子含量变化以及Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路相关因子表达。结果 与假手术组相比,IS组神经功能评分、脑梗死率、脑水肿含量、铁离子含量显著增加,Nrf2、SLC7A11、GPX4表达显著降低(P <0.05);与IS组相比,治疗组神经功能评分、脑梗死率、脑水肿含量、铁离子含量显著下降,Nrf2、SLC7A11、GPX4表达显著增加(P <0.05);抑制剂组逆转了治疗组对IS大鼠神经保护。结论 布洛芬可以保护IS大鼠神经受损,可能与激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路有关。

二甲双胍经Nrf2-Gpx4通路抑制铁死亡并减轻非酒精性脂肪性肝病大鼠的肝损伤

目的:基于核因子E2相关因子2(Nrf2)-谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)介导的铁死亡通路探究二甲双胍(Met)对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝损伤发挥保护作用的分子机制。方法:SPF级雄性SD大鼠给予高脂饲料喂养建立NAFLD模型,对照(control)组大鼠给予普通饲料喂养。喂养12周后,将模型大鼠随机分为NAFLD组、Met低剂量(Met-L)组、Met高剂量(Met-H)组和Met+brusatol(Nrf2抑制剂)组,每组8只。Met-L、Met-H组大鼠分别给予100、200 mg/kg Met灌胃,每天1次;Met+brusatol组大鼠在给予200 mg/kg Met灌胃的同时隔天腹腔注射2 mg/kg brusatol;control组和NAFLD组大鼠给予等量生理盐水灌胃和腹腔注射,连续6周。给药结束后,检测血清中肝功能相关指标[天门冬氨酸氨基转氨酶(AST)和丙氨酸氨基转氨酶(ALT)]、血脂[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)]及炎症因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素6(IL-6)]的水平;比色法检测肝组织匀浆中铁离子含量,TBA法检测丙二醛(MDA)含量,微量酶标法检测谷胱甘肽(GSH)含量,DCFH-DA荧光探针法检测活性氧(ROS)含量;HE染色检测肝组织病理学变化;油红O染色检测肝细胞脂质积累情况;普鲁士蓝染色检测肝脏中铁沉积情况;Western blot和RT-qPCR检测肝组织中Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)、Gpx4及胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白(xCT)的蛋白和mRNA的表达。结果:与control组相比,NAFLD组血清ALT、AST、TNF-α、IL-6、TC、TG和LDL-C水平、肝组织铁离子含量、MDA和ROS水平、肝组织NAS评分、油红O染色及普鲁士蓝染色阳性面积百分比显著升高(P<0.05),血清HDL-C水平、肝组织GSH含量及Nrf2、HO-1、Gpx4和xCT的蛋白和mRNA表达显著降低(P<0.05),肝细胞排列紊乱、肿胀,细胞内存在脂滴空泡,有明显的炎症细胞浸润、脂质蓄积和铁沉积;与NAFLD组相比,Met-L和Met-H组血清ALT、AST、TNF-α、IL-6、TC、TG和LDL-C水平、肝组织铁离子含量、MDA和ROS水平、肝组织NAS评分、油红O染色及普鲁士蓝染色阳性面积百分比显著降低(P<0.05),血清HDL-C水平、肝组织GSH含量及Nrf2、HO-1、Gpx4和xCT的蛋白和mRNA表达显著升高(P<0.05),肝细胞脂肪变性减轻,炎症细胞浸润、脂质蓄积和铁沉积减少;Nrf2抑制剂brusatol能明显逆转Met对Nrf2/Gpx4通路的激活作用以及NAFLD大鼠肝脏的保护作用。结论:二甲双胍可能通过激活Nrf2/Gpx4通路,抑制铁死亡,减轻脂质过氧化程度,从而对NAFLD大鼠肝脏发挥保护作用。

西红花酸调控Nrf2/HO-1通路抑制高糖诱导人肾小球系膜细胞铁死亡

目的 探讨西红花酸抑制高糖诱导人肾小球系膜细胞(HGMCs)铁死亡的作用机制。方法 (1)体外培养HGMCs,将细胞分为空白对照组、阴性对照组(60 mmol·L^(-1)甘露醇)和葡萄糖实验组(30、60、90 mmol·L^(-1)),干预培养48 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率,采用RT-qPCR法检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)mRNA表达,以确定高糖诱导HGMCs的造模条件。(2)体外培养HGMCs,分为空白对照组和西红花酸给药组(5、25、125μmol·L^(-1)),干预培养24 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率。(3)体外培养HGMCs,将细胞分为空白对照组、模型组(60 mmol·L^(-1)葡萄糖)、西红花酸组(60 mmol·L^(-1)葡萄糖+5、25、125μmol·L^(-1)西红花酸)及阳性对照组[60 mmol·L^(-1)葡萄糖+1μmol·L^(-1)铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)]。干预培养48 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western Blot法检测细胞GPX4、血红素加氧酶-1(HO-1)、转铁蛋白受体(TFRC)蛋白表达;采用免疫荧光法与Western Blot法检测HGMCs细胞核中核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白表达。结果 (1)与空白对照组比较,阴性对照组的细胞存活率及GPX4mRNA表达水平无明显差异(P>0.05);30、60、90 mmol·L^(-1)葡萄糖实验组的细胞存活率及GPX4 mRNA表达水平均显著降低(P<0.01),且以60 mmol·L^(-1)浓度组作用最为明显。(2)与空白对照组比较,5μmol·L^(-1)西红花酸组的HGMCs细胞存活率无明显影响(P>0.05),25、125μmol·L^(-1)西红花酸组的HGMCs细胞存活率显著升高(P<0.01),该浓度西红花酸对HGMCs无明显细胞毒性。(3)与空白对照组比较,模型组的HGMCs细胞存活率显著降低(P<0.01);细胞内ROS水平显著上升(P<0.01);GPX4蛋白表达水平明显下降(P<0.05);细胞核内Nrf2蛋白表达显著下调(P<0.001)。与模型组比较,25、125μmol·L^(-1)西红花酸组的HGMCs细胞存活率明显升高(P<0.05);细胞内ROS水平均显著下降(P<0.01),并呈浓度依赖性;西红花酸125μmol·L^(-1)组HGMCs细胞GPX4、HO-1蛋白表达水平明显上调(P<0.05,P<0.01),与阳性对照药物Fer-1效果相近(P>0.05);西红花酸125μmol·L^(-1)组HGMCs细胞核内Nrf2蛋白表达显著上调(P<0.001)。各组间的HGMCs细胞TFRC蛋白表达无明显差异(P>0.05)。结论 西红花酸能够抑制高糖诱导HGMCs细胞铁死亡,减少细胞内ROS生成,上调GPX4蛋白表达,可能与上调Nrf2/HO-1通路密切相关。

贝那普利对肝纤维化大鼠NOX4和Nrf2的影响

目的探讨贝那普利对肝纤维化大鼠NOX4和Nrf2的影响及其抗纤维化的机制。方法22只清洁级健康雄性SD大鼠随机分为3组:对照组6只,模型组和治疗组各8只。模型组和治疗组皮下注射40%四氯化碳油剂,建立大鼠肝纤维化模型,对照组予等剂量的油剂皮下注射,均为2次/周,共8周;在造模同时,治疗组予贝那普利10 mg/(kg·d)灌胃,其余两组予等剂量生理盐水灌胃,共8周。免疫组织化学法测定肝组织中NOX4和Nrf2的水平。结果与对照组相比,模型组肝组织中NOX4和Nrf2阳性蛋白的平均光密度值升高(NOX4:0.095±0.008 vs 0.212±0.007;Nrf2:0.073±0.005 vs 0.154±0.008),差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,治疗组肝组织NOX4阳性蛋白平均光密度值降低(0.212±0.007 vs 0.150±0.004),Nrf2阳性蛋白平均光密度值升高(0.154±0.008 vs 0.177±0.007),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论贝那普利可能通过降低NOX4的水平和升高Nrf2的水平减轻肝纤维化的程度。

龙胆苦苷对非酒精性脂肪肝TLR-4/NF-κB和AMPK/Nrf2通路的影响

探讨龙胆苦苷(GPS)对非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠的保护作用及TLR-4/NF-κB和AMPK/Nrf2通路的影响。将60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、二甲双胍组(200 mg/kg)和GPS高、中、低剂量组(120、60、30 mg/kg)。正常组给予标准饲料,其余各组给予高脂饲料饲养14周,建立大鼠NAFLD模型。生化法检测肝功能、氧化应激和脂质积累情况,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胰岛素抵抗和炎症因子水平,蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测大鼠肝组织中TLR-4/NF-κB和AMPK/Nrf2通路蛋白表达情况;油红O染色观察肝脏组织病理学变化。结果表明,GPS可降低NAFLD大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹血糖(FBG)和空腹胰岛素(FINS)的活性或含量,增强血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和高密度脂蛋白(HDL-C)含量,改善胰岛素抵抗情况,降低肝脏中白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、NF-κBp-p65和TLR-4的表达水平,提高p-AMPK与Nrf2蛋白表达水平。由此可见,GPS改善NAFLD的作用机制可能与抑制氧化应激、炎症反应和调控TLR-4/NF-κB、AMPK/Nrf2信号通路有关。

银杏素调节Nrf2、SLC7A11、GPX4信号通路对卵巢癌细胞及铁死亡的影响

目的:探讨银杏素调节核因子E_(2)相关因子2(Nrf2)、非糖基化的xCT(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路对卵巢癌(OC)细胞增殖、凋亡和铁死亡的影响。方法:选取对数生长期SKOV3细胞,设置对照组、Nrf2激活剂-莱菔硫烷(SFN,20μmol SFN)组、银杏素低浓度组(2.5μM)、中浓度组(5μM)、高浓度(10μM)组、银杏素高浓度+SFN(10μM银杏素+20μmol SFN)组,对照组无需处理,其余各组按照相应药物浓度进行处理。MTT法检测各组SKOV3细胞增殖率;Western blot检测各组SKOV3细胞中Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平;qRT-PCR检测各组SKOV3细胞铁死亡影响因子SLC7A11、GPX4 mRNA表达水平;流式细胞仪检测各组SKOV3细胞凋亡率;qRT-PCR检测各组SKOV3细胞铁死亡影响因子SLC7A11、GPX4 mRNA表达水平;试剂盒检测各组SKOV3细胞铁水平变化;Western blot检测各组SKOV3细胞中Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平。结果:与对照组相比,SFN组增殖率(124.71±12.49)%、Nrf2(1.15±0.12)、SLC7A11(1.58±0.16)、GPX4(1.08±0.11)表达均升高,凋亡率(4.01±0.41)%、铁水平(24.73±2.48)下降(P<0.05),而银杏素低、中、高浓度组增殖率(74.22±7.43、51.03±5.11、35.23±3.53)%、Nrf2(0.62±0.07、0.41±0.05、0.18±0.02)、SLC7A11(0.56±0.06、0.37±0.04、0.16±0.02)、GPX4(0.61±0.07、0.43±0.05、0.21±0.03)表达均下降,凋亡率(14.55±1.46、28.17±2.82、42.01±4.21)%、铁水平(48.99±4.91、60.83±6.10、77.87±7.79)依次增加(均P<0.05);与银杏素高浓度+SFN组增殖率(65.09±6.51)%、Nrf2(0.48±0.05)、SLC7A11(0.46±0.05)、GPX4(0.55±0.06)表达相比,银杏素高浓度组增殖率、Nrf2、SLC7A11、GPX4表达及SFN组均有差异(均P<0.05)。结论:银杏素可以抑制OC细胞系SKOV3细胞的增殖,诱导其凋亡及铁死亡,可能与抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路有关。

灵芝酸A通过激活Nrf2/GPX4信号通路减轻七氟烷诱导的HT22细胞铁死亡

目的研究灵芝酸A(ganoderic acid A,GAA)对七氟烷诱导的HT22细胞铁死亡的影响和机制。方法采用CCK-8法检测不同浓度GAA对HT22细胞的增殖活性,筛选出合适的GAA处理浓度。将HT22细胞分成对照组、七氟烷诱导组(Sev组)、GAA-25μmol/L组、GAA-50μmol/L组、GAA-100μmol/L组。对照组细胞按照常规方法处理;其他组均利用七氟烷进行诱导处理,同时不同浓度GAA组给予相应浓度的GAA干预。采用Western blot检测氧化应激相关因子(Nrf2、GPX4)与铁死亡相关因子(ACSL4、SLC7A11)的蛋白表达。利用相应的试剂盒检测Fe^(2+)、ROS、MDA、GSH、4-HNE等因子的含量。结果根据CCK-8实验结果,选择对HT22细胞增殖活性无影响的25、50、100μmol/L GAA进行后续研究。与对照组比较,Sev组的HT22细胞存活率降低(P<0.05),Nrf2、GPX4、ACSL4、SLC7A11蛋白表达减少(P<0.05),Fe^(2+)、ROS、MDA、4-HNE含量升高(P<0.05),GSH含量降低(P<0.05)。与Sev组比较,随着CAA处理浓度的升高,HT22细胞存活率显著升高(P<0.05),Nrf2、GPX4、ACSL4、SLC7A11蛋白表达增多(P<0.05),Fe^(2+)、ROS、MDA、4-HNE含量降低(P<0.05),GSH含量升高(P<0.05)。结论GAA通过激活Nrf2/GPX4信号通路减轻七氟烷诱导的HT22细胞铁死亡,从而发挥神经保护作用。GAA可作为治疗七氟烷麻醉神经损伤的潜在药物。

肝纤维化过程中肝组织中Nrf2、NOX4 mRNA表达及血清ROS水平的变化

目的研究肝纤维化过程中肝组织中核因子E2相关因子2(Nrf2)mRNA、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)mRNA和血清活性氧簇(ROS)的变化及其相互之间的关系,探索三者在肝纤维化形成过程中的作用。方法将30只雄性SD大鼠随机分为两组,正常对照组6只,模型组24只,采用四氯化碳(CCl4)腹部皮下注射制备大鼠肝纤维化模型,共8周。各组肝损伤的评估采用常规HE和Masson染色。逆转录PCR检测肝组织中Nrf2 mRNA、NOX4 mRNA水平,比色法测定血清ROS水平。所有数据均采用SPSS 23.0统计软件进行分析。结果2、4、6、8周时模型组Nrf2 mRNA表达水平分别为0.53±0.49、1.51±1.63、3.35±2.68、4.01±3.40,均较对照组(0.12±0.11)升高(P均<0.05);NOX4 mRNA的表达水平分别为6.53±0.89、5.49±1.24、14.49±2.39、31.78±3.96,均较对照组(2.03±0.31)升高(P均<0.05)。此外,2、4、6、8周时模型组血清ROS水平升高,分别为(1.84±0.69)μg/mL、(1.72±0.65)μg/mL、(2.48±1.14)μg/mL、(1.82±0.46)μg/mL,均较对照组[(1.56±0.84)μg/mL]升高(P均<0.05)。Pearson相关性分析显示,Nrf2与ROS、Nrf2与NOX4、NOX4与ROS之间均存在正相关性。结论肝纤维化形成过程中肝组织中Nrf2、NOX4及血清ROS水平均升高,但Nrf2水平的升高幅度较NOX4低,三者的变化可能参与了肝纤维化的发生。

白虎加人参汤加减方对2型糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4表达及抗氧化应激作用机制的研究

目的探讨白虎加人参汤加减方对2型糖尿病(T2DM)大鼠骨骼肌葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)表达及抗氧化应激作用的影响及机制。方法将SD大鼠随机分为对照组、模型组、阳性药组(二甲双胍,200 mg·kg^(-1))及白虎加人参汤加减方高、低剂量组(37.8、18.9 g·kg^(-1)),每组8只。采用高脂高糖饲料喂养4周后,一次性腹腔注射STZ 40 mg·kg^(-1)复制T2DM大鼠模型;灌胃给药(10 mL·kg^(-1)),每日1次,连续8周,T2DM大鼠继续给予高脂高糖饲料喂养。给药期间每2周测定1次空腹血糖(FBG)值;给药结束后,测定大鼠糖化血红蛋白(HbA1c)、血清胰岛素(INS)水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);测定大鼠胰腺组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及丙二醛(MDA)水平;qRT-PCR法检测肌肉组织中GLUT4 mRNA表达水平;Western Blot法检测肌肉组织中GLUT4蛋白及胰腺组织中蛋白激酶B(AKT)/糖原合成激酶3β(GSK-3β)/核因子NF-E2相关因子(Nrf2)通路相关蛋白表达水平;免疫组织化学法检测胰腺组织中血红素加氧酶1(HO-1)、n-Nrf2蛋白表达水平。结果与对照组比较,模型组大鼠的FBG、HbA1c及HOMA-IR明显升高(P<0.05),血清INS水平明显降低(P<0.05);胰腺组织的CAT、SOD、GSH-Px水平均明显降低(P<0.05),MDA水平明显升高(P<0.05);肌肉组织中GLUT4蛋白及mRNA表达水平明显降低(P<0.05);胰腺组织中的p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达水平明显降低(P<0.05),n-Nrf2、n-Fyn、HO-1蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较,白虎加人参汤加减方组大鼠第4、6、8周的FBG水平及HbA1c、HOMA-IR均明显降低(P<0.05),血清INS水平明显升高(P<0.05);胰腺组织中CAT、SOD、GSH-Px水平明显升高(P<0.05),MDA水平明显降低(P<0.05);肌肉组织中GLUT4蛋白及mRNA表达水平均明显升高(P<0.05);胰腺组织中p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、n-Nrf2、HO-1蛋白表达水平明显升高(P<0.05),n-Fyn蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论白虎加人参汤加减方可能通过上调骨骼肌GLUT4表达来改善T2DM大鼠的胰岛素抵抗,并可能通过调控AKT/GSK-3β/Nrf2通路发挥抗氧化应激作用。

川芎嗪激活Nrf2/HO-1/CXCR4通路调控神经干细胞迁移干预缺血再灌注大鼠的作用机制

以核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)/趋化因子C-X-C-基元受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)通路为切入点,探讨川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)干预大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠脑内神经干细胞(neural stem cells,NSCs)迁移的作用机制。SD大鼠分为假手术组、模型组、TMP 20 mg·kg^(-1)组和TMP 40 mg·kg^(-1)组;通过神经功能缺失评分评价神经功能损伤;免疫荧光法检测脑组织5-溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)/双皮质素(doublecortin,DCX)双标细胞;观察TMP对C17.2细胞迁移的影响;蛋白免疫印迹法检测脑组织和C17.2细胞中Nrf2、HO-1、p62、醌氧化还原酶1[NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1]、基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)、CXCR4蛋白表达。结果显示,大鼠脑缺血7、21 d后,神经功能损伤评分及BrdU+/DCX+细胞显著升高,脑组织中Nrf2及CXCR4表达均显著升高;与模型组相比,TMP 40 mg·kg-1可显著降低神经功能评分,进一步升高BrdU+/DCX+细胞数量及Nrf2、CXCR4及SDF-1表达;此外TMP可以显著促进C17.2细胞迁移,且时间以及剂量依赖性提高p62、Nrf2、HO-1、NQO1表达,TMP 50μg·mL^(-1)给药12 h表达量最高(P<0.01)。综上,TMP可通过活化Nrf2/HO-1/CXCR4通路,促进NSCs迁移从而发挥抗缺血再灌注损伤作用。该研究为TMP在缺血性脑卒中疾病中的应用提供了实验支持。

基于Nrf2/HO-1/GPX4信号通路探讨真武汤改善脾肾阳虚型糖尿病肾病小鼠的作用机制

目的:基于核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路探讨真武汤对脾肾阳虚型糖尿病肾病(DKD)小鼠肾脏氧化损伤的干预作用及机制。方法:将25只7周龄SPF级雄性db/m小鼠及95只7周龄SPF级雄性db/db小鼠适应性喂养1周。db/m小鼠作为空白组,其余小鼠进行运用灌服生大黄溶液和氢化可的松制备脾肾阳虚型DKD模型,成模后随机分为模型组、厄贝沙坦组(25 mg·kg^(-1))、真武汤高、中、低剂量(33.8、16.9、8.45 g·kg^(-1))组,每组15只,连续灌胃8周。观察小鼠生存状态和计算中医证候评分并测定脾肾阳虚相关、空腹血糖(FBG)及肾功能相关指标;苏木素-伊红(HE)染色观察各组肾脏组织病理学改变;生化试剂盒法测定肾组织中氧化应激相关指标;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠肾组织中Nrf2、HO-1、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、GPX4 m RNA和蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组小鼠中医证候积分明显升高(P<0.05),雌二醇(E2)含量明显升高(P<0.05),睾酮(T)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)含量明显降低(P<0.05);FBG明显升高(P<0.05),肾功能明显下降(P<0.05);肾脏病理显示肾小球肥大,肾小球系膜和基底增厚明显,肾组织中过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)、还原型谷胱甘肽(GSH)水平均明显降低(P<0.05),丙二醛(MDA)的含量明显升高(P<0.05),肾组织中Nrf2、HO-1、GCLC、GPX4 m RNA及蛋白表达水平明显下降(P<0.05);与模型组比较,真武汤高、中剂量组中医证候积分明显降低、E2含量明显降低(P<0.05),T、T3、T4含量明显升高(P<0.05);肾功能明显改善(P<0.05),肾脏病理明显改善,真武汤高、中剂量组小鼠肾组织中CAT、T-AOC、GSH水平均明显升高(P<0.05),MDA的含量明显下降(P<0.05),各给药组小鼠肾组织中Nrf2、HO-1、GCLC、GPX4 m RNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:真武汤改善脾肾阳虚型db/db小鼠一般状态、肾功能,降低氧化损伤和减轻肾脏病理改变,其作用机制可能与调节Nrf2/HO-1/GPX4通路有关。