肺复方通过PI3K/Akt/Nrf2信号通路对A549/DDP细胞耐药性的影响

目的观察肺复方对人肺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞耐药性的作用及对PI3K/Akt/Nrf2信号通路的影响。方法选用A549/DDP细胞设立不含药血清的空白对照组、肺复方组、顺铂组、联合组,流式细胞术检测各组细胞周期分布和细胞中活性氧(ROS)的变化,Western blotting和RT-PCR检测PI3K/Akt/Nrf2信号通路及下游血红素氧合酶1(HO-1)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)的表达变化。结果与空白对照组、顺铂组相比,联合组引起细胞G1期阻滞,增加细胞内活性氧的累积,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与空白对照组比,肺复方组和联合组能减少Nrf2核转位,下调p-Akt、HO-1、NQO1、MRP1蛋白表达和mRNA表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论肺复方能够通过调控PI3K/Akt/Nrf2信号通路增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。

干预自噬调控p62-Keap1/Nrf2-GPX4通路对结直肠癌细胞铁死亡及奥沙利铂耐药的影响

目的探讨干预自噬对结直肠癌细胞铁死亡和奥沙利铂(OXA)耐药的影响及分子机制。方法培养人结直肠癌HCT-8、COLO205、HCT-116、SW620和SW480细胞系,筛选LC3表达适中的HCT-116细胞,检测其与OXA耐药HCT-116/OXA细胞株LC3、p62、Keap1、Nrf2、GPX4蛋白及Fe^(2+)、GSH、MDA的表达差异,并应用自噬和铁死亡干预剂并联合OXA干预HCT-116/OXA细胞株,检测LC3、p62、Keap1、Nrf2、GPX4蛋白及Fe^(2+)、GSH、MDA的表达,CCK-8实验检测各组细胞的增殖活性及对OXA的敏感性,平板克隆、Transwell实验检测各组细胞的生长情况和侵袭能力。结果5组细胞中HCT-116细胞的LC3、p62和GPX4均呈中等表达量;与HCT-116细胞相比,HCT-116/OXA细胞对OXA敏感性较低,且p62、Nrf2、GPX4蛋白呈高表达,LC3和Keap1呈低表达,Fe^(2+)、GSH、MDA表达水平均增高(P<0.05);自噬激活剂Rapa组及Rapa+Fer-1组较Fer-1组和对照组的LC3、Keap1蛋白及Fe^(2+)、MDA水平均升高,而p62、Nrf2、GPX4蛋白及GSH水平呈低表达,且Rapa+Fer-1组GPX4蛋白、GSH的水平低于Rapa组(P<0.05)。在自噬抑制剂组中,CQ组及CQ+Erastin组与对照组和Erastin组相比其LC3、p62、Nrf2、GPX4蛋白及GSH水平均呈高表达,Keap1蛋白、Fe^(2+)、MDA均呈低表达,而Erastin组GPX4蛋白、GSH表达低于其余三组,Fe^(2+)、MDA含量高于其余三组(P<0.05)。自噬激活剂联合应用OXA,Rapa干预组与其余三组相比,其对OXA的化学敏感性高、迁移细胞数量少、细胞增殖活性低;Rapa+Fer-1组对OXA的敏感性低于Rapa组,但高于Fer-1组和对照组(P<0.05)。而Fer-1组与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。自噬抑制剂联合应用OXA,Erastin、CQ+Erastin和CQ三组与对照组相比其细胞活性、迁移能力和克隆形成能力均降低,其中Erastin组最低,而CQ+Erastin组高于Erastin组、低于CQ组(P<0.05)。结论在结直肠癌中,自噬参与了铁死亡的调节,干预自噬可通过p62-Keap1/Nrf2-GPX4通路调控结直肠癌细胞发生铁死亡,从而逆转OXA耐药。

茯苓酸通过Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路调控铁死亡改善阿尔茨海默病大鼠认知障碍的研究

背景阿尔茨海默病(AD)是一种常见且不可逆转的神经退行性脑疾病,严重影响患者的生活品质和生存质量,目前仍缺乏有效的治疗方法延缓或阻止疾病进展。中药及其活性成分在防治AD方面具有重要潜力。目的探讨茯苓酸(PA)对AD大鼠认知障碍及核因子E2相关因子2(Nrf2)/溶质载体家族7A11(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路的影响。方法2022年1—9月将75只6~8周龄雄性SPF级SD大鼠依据随机数字表法分为对照组(Control组)、AD模型组(Model组)、PA治疗组(PA组),PA+Nrf2抑制剂组(PA+ML385组),除Control组外制备AD大鼠模型。造模成功后,PA组腹腔注射50 mg/kg PA,PA+ML385组腹腔注射50 mg/kg PA+30 mg/kg Nrf2抑制剂ML385,Control组与Model组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。末次给药24 h后进行Morris水迷宫实验,第2、4、6天进行定位航行实验,记录大鼠到达平台的时间(逃避潜伏期),第7天移走平台,记录大鼠在120 s内滞留平台时间和穿越平台次数。Nissl染色后观察各组大鼠海马神经元病理变化,普鲁士蓝染色检测海马组织铁沉积,免疫荧光染色检测海马神经元GPX4表达,检测海马组织谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、Fe2+含量,蛋白质印迹法(Western blotting)检测大鼠海马组织Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达。结果末次给药第2、4、6天Model组逃避潜伏期高于Control组、PA组,PA+ML385组高于PA组,差异有统计学意义(P<0.05);Model组平台停留时间、穿越平台次数低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05)。Nissl染色结果示Model组神经元坏死严重,细胞核皱缩,尼氏体数目减少;PA组神经元坏死减少,排列紧密且尼氏体增多;PA+ML385组神经元损伤明显加重,尼氏体数目减少。普鲁士蓝染色结果示Model组铁沉积较Control组增加,与Model组比较,PA组铁沉积减少,PA+ML385组较PA组铁沉积增多。免疫荧光染色结果示Model组绿色荧光减弱,GPX4阳性细胞减少,PA组细胞绿色荧光较Model组增强,GPX4阳性细胞增多,PA+ML385组较PA组GPX4阳性细胞减少。Model组GSH低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05);Model组MDA、Fe2+高于Control组、PA组,PA+ML385组高于PA组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Model组Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白相对表达量低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PA可改善AD大鼠认知障碍,其机制可能与通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡有关。

壮通饮通过Nrf2-SCL7A11/xCT-Gpx4通路调控铁死亡改善脑缺血再灌注损伤

【目的】探究壮通饮通过Nrf2-SCL7A11/xCT-Gpx4通路调控铁死亡对大脑中动脉栓塞模型小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。【方法】将C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(MCAO)、低剂量壮通饮组(ZTY-L+MCAO),高剂量壮通饮组(ZTY-H+MCAO),每组5只。其中MCAO组采用硅胶线栓法进行造模,小鼠大脑中动脉栓塞1h,拔出线栓再灌注72h后进行心脏灌注取脑,Sham组除了不插入线栓其余操作同MCAO组。采用Zea-Longa法对小鼠神经功能进行评分;采用TTC染色评估小鼠脑梗死体积;采用HE染色、尼氏染色评估脑损伤程度;采用普鲁士蓝染色评价三价铁离子蓄积水平;qPCR检测铁离子转运相关载体受体TfR1和DMT1、脂质过氧化相关基因ACSL4以及铁死亡标志物PTGS2 mRNA表达;ELISA试剂盒检测4-HNE的含量评估小鼠大脑脂质过氧化水平;Western-blot、免疫荧光检测小鼠脑组织中Nrf2、SCL7A11/xCT、Gpx4蛋白水平。【结果】①壮通饮改善了MCAO/R后小鼠神经功能(P<0.05)和大脑梗死体积(P<0.05)及缓解MCAO/R后大脑皮层细胞病理损伤。②壮通饮减弱了MCAO/R后小鼠大脑组织的三价铁离子蓄积状态;减少MCAO/R后小鼠大脑中与铁离子转运入细胞内相关载体TfR1和DMT1 mRNA的表达(P<0.001);下调MCAO/R后小鼠大脑脂质过氧化物4-HNE含量和组织脂质过氧化物酶ACSL4 mRNA表达(P<0.001);降低MCAO/R后小鼠大脑铁死亡标志物PTGS2 mRNA表达(P<0.001)。③壮通饮增加MCAO/R后Nrf2入核表达(P<0.001),以及增加xCT和Gpx4在神经元中的表达(P<0.001)。【结论】壮通饮能够改善MCAO/R小鼠神经功能和脑梗死体积,缓解大脑皮层细胞病理损伤,影响Nrf2-SCL7A11/xCT-Gpx4通路关键信号分子表达,所以壮通饮改善小鼠MCAO/R损伤的作用机制可能是通过Nrf2-SCL7A11/xCT-Gpx4通路调节铁死亡水平达到的。

基于Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路探讨附芍地芩方抗结直肠癌作用机制

目的探讨附芍地芩方治疗结直肠癌的作用机制。方法体外细胞实验用附芍地芩方处理结直肠癌CT-26细胞,检测细胞增殖、迁移能力。流式细胞术检测结直肠癌CT-26细胞的活性氧(ROS)水平,并检测其铁离子(Fe^(2+))、丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性。PCR Array与Western blot方法分析验证铁死亡差异基因表达情况。体内动物实验将Balb/c小鼠随机分为空白对照组、模型组、奥沙利铂组(1.5 mg·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方低剂量组(4.49 g·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方中剂量组(8.97 g·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方高剂量组(17.94 g·kg^(-1)·d^(-1)),检测附芍地芩方对小鼠肿瘤组织Fe^(2+)、ROS、MDA水平,SOD活性及Nrf2、Keap1、SLC7A11、GPX4表达水平的影响。结果体外细胞实验显示,与空白对照组相比,附芍地芩方通过剂量依赖的方式显著抑制了结直肠癌CT-26细胞的增殖与迁移。附芍地芩方可以提高结直肠癌CT-26细胞中的Fe^(2+)(P<0.05)与ROS水平(P<0.01);提高结直肠癌CT-26细胞内MDA水平(P<0.01),并显著降低SOD活性(P<0.01)。铁死亡PCR Array分析发现,与空白对照组比较,附芍地芩方干预后,基因GPX4、SLC7A11表达显著下调,GSTA1、HMOX1、Ca9、Chac1、Keap1、Sqstm1、NOX1、FTH1、Tfr1、SAT2、Pparg、Hamp表达显著上调。Western blot实验检测发现,附芍地芩方干预后,结直肠癌CT-26细胞Keap1蛋白表达上调(P<0.01),Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达下调(P<0.01)。体内动物实验结果显示,附芍地芩方显著抑制小鼠皮下移植瘤的生长(P<0.05),肿瘤组织坏死程度增加,Fe^(2+)、ROS以及MDA水平增加(P<0.05,P<0.01),SOD活性下降(P<0.01),且肿瘤组织中Keap1蛋白表达上调(P<0.01),Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达下调(P<0.01)。结论附芍地芩方具有抗结直肠癌作用,并可能通过抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路促进结直肠癌细胞铁死亡以发挥抗结直肠癌作用。

双路通脑方调节SIRT1/Nrf2/GPx4信号通路对缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡的影响

目的探讨双路通脑方对缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡的作用以及对沉默信息调节因子2同源物1(SIRT1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)信号通路的调节机制。方法采用随机数字表法选取20只大鼠作为假手术组,剩余70只大鼠均利用大脑中动脉闭塞法制备缺血性脑卒中大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、双路通脑方组、双路通脑方+SIRT1抑制剂组(双路通脑方+EX527组),每组20只。14 d后,对大鼠进行神经功能损伤评分;TTC染色检测大鼠脑梗死面积;HE染色检测大鼠脑组织病理变化;尼氏染色检测大鼠脑组织神经元数量;试剂盒检测大鼠脑组织中铁离子(Fe^(2+))、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的水平;免疫组化检测大鼠脑组织中酰基-辅酶a合成酶长链家族成员4(ACSL4)、转铁蛋白受体(TFR)、铁蛋白重链多肽1(FTH1)蛋白的阳性表达;Western blotting法检测大鼠脑组织中SIRT1、Nrf2、GPx4及胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(SLC7A11)蛋白的表达。结果与假手术组比较,模型对照组大鼠的神经功能缺损评分、脑梗死面积、Fe^(2+)和MDA含量、ACSL4、TFR蛋白表达升高(P<0.05),神经元数量、SOD和GSH含量、FTH1、SIRT1、Nrf2、GPx4及SLC7A11蛋白表达均降低(P<0.05);与模型对照组比较,双路通脑方组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积、Fe^(2+)和MDA含量、ACSL4、TFR蛋白表达降低(P<0.05),神经元数量、SOD和GSH含量、FTH1、SIRT1、Nrf2、GPx4及SLC7A11蛋白表达均升高(P<0.05);采用SIRT1抑制剂进行回补实验,结果显示SIRT1抑制剂逆转了双路通脑方对神经元铁死亡的抑制作用,同时也抑制了Nrf2和GPx4的表达(P<0.05)。结论双路通脑方可能通过激活SIRT1/Nrf2/GPx4信号通路来抑制缺血性脑卒中大鼠神经元铁死亡。

苍术素调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对脑胶质瘤细胞铁死亡的影响

目的探讨苍术素调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对脑胶质瘤细胞铁死亡的影响及其机制。方法体外培养脑胶质瘤U251细胞,将U251细胞分为对照组、苍术素低剂量组(5 mol/L)、中剂量组(10 mol/L)、高剂量组(20 mol/L)、ML385组(Nrf2抑制剂1 mol/L)。MTT和Edu实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;试剂盒检测亚铁离子(Fe^(2+))、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)水平;Western blot检测Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达;建立脑胶质瘤裸鼠模型,观察肿瘤生长情况,检测肿瘤组织中Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白水平。结果细胞实验结果显示,与对照组比较,苍术素低、中、高剂量组U251细胞Fe^(2+)、MDA、LDH、ROS水平、细胞凋亡率、cleaved-caspase3水平显著性升高,GSH水平、OD490(24 h、48 h)值和细胞增殖率、Ki-67、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与苍术素高剂量组比较,ML385组U251细胞各检测指标水平无统计学差异(P>0.05);裸鼠成瘤实验结果表明,与模型组比较,苍术素组和ML385组裸鼠肿瘤质量和肿瘤体积、裸鼠肿瘤组织中Ki-67、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著性降低,cleaved-caspase3蛋白表达水平显著性升高(P<0.05);与苍术素组比较,ML385组裸鼠肿瘤质量、肿瘤体积、抑瘤率和各蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05)。结论苍术素可能通过抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路促进脑胶质瘤细胞铁死亡。

基于Nrf2/ROS信号通路探讨岩藻多糖对食管癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨岩藻多糖对食管癌增殖的影响,并分析其机制。方法:MTT法分析细胞增殖抑制率,Hoechst 33258染色和流式细胞术检测细胞凋亡,DCFH-DA探针检测ROS水平,Western blot法分析Nrf2、HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax、caspase-3水平,研究岩藻多糖对细胞增殖以及Nrf2/ROS信号通路的影响。裸鼠成瘤实验验证岩藻多糖对瘤体的瘤重、瘤体积及Nrf2、HO-1、NQO-1水平的影响。结果:1~16µg/mL岩藻多糖极显著抑制ECA109细胞增殖,48 h IC50为3.26µg/mL。与对照组(0.1%DMSO)相比,1、2、4µg/mL岩藻多糖处理后的ECA109细胞出现核凝聚、染色质不规则收缩、凋亡小体等明显的凋亡特征,(极)显著促进ECA109细胞凋亡,极显著下调Bcl-2表达水平,极显著上调Bax、Cleaved-caspase-3表达水平,极显著增加ROS水平,极显著降低Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白水平(P<0.05,P<0.01);Nrf2过表达能显著下调岩藻多糖抑制ECA109细胞增殖效果,显著下调ROS水平,显著上调Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白水平(P<0.05)。体内实验显示,50、100 mg/kg岩藻多糖极显著抑制瘤体体积、瘤体质量,下调瘤体Nrf2、HO-1、NQO-1水平(P<0.05)。结论:岩藻多糖抑制ECA109细胞增殖,对体内移植瘤抑瘤效果显著,其机制与调控Nrf2/ROS信号通路有关。

西黄胶囊联合西妥昔单抗通过Nrf2/HO-1信号通路调控结直肠癌细胞凋亡、迁移以及侵袭的作用机制研究

目的研究西黄胶囊联合西妥昔单抗通过Nrf2/HO-1信号通路对结直肠癌细胞凋亡、迁移以及侵袭的调控作用。方法使用细胞计数试剂盒(CCK8)确定西黄胶囊和西妥昔单抗对结直肠癌HCT-116细胞活力的影响。使用流式细胞术、划痕法和侵袭小室法检测西黄胶囊联合西妥昔单抗对结直肠癌HCT-116细胞凋亡、迁移以及侵袭的影响。使用蛋白质印迹技术检测西黄胶囊联合西妥昔单抗对结直肠癌HCT-116细胞B细胞淋巴瘤2(BCL2)、BCL2关联X蛋白(BAX)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、锌指蛋白232(ZNF320)、血管内皮生长因子A(VEGA)、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、核因子E2相关因子2(NRF2)和血红素氧合酶1(HO-1)表达的影响。结果CCK8实验结果显示,西黄胶囊和西妥昔单抗对HCT-116细胞活力最佳抑制时间是72 h,IC 50分别为5.28%和170.20 mg/L。与对照组相比,西黄胶囊和西妥昔单抗增加HCT-116细胞的凋亡(P<0.05)、抑制HCT-116细胞迁移以及侵袭(P<0.05)。与单独使用西黄胶囊或西妥昔单抗相比,西黄胶囊联合西妥昔单抗对HCT-116细胞的促凋亡效果和对迁移以及侵袭的抑制效果更加明显(P<0.05)。蛋白质印迹技术结果显示,与对照组比较,西黄胶囊和西妥昔单抗促进HCT-116细胞的BAX表达(P<0.05),抑制BCL2、MMP2、MMP9、ZNF320、VEGA、GSK3B、NRF2、HO-1的表达(P<0.05)。此外,与单独使用西黄胶囊或西妥昔单抗相比,西黄胶囊联合西妥昔单抗的效果更加明显(P<0.05)。结论西黄胶囊联合西妥昔单抗可能通过抑制Nrf2/HO-1信号通路抑制结直肠癌HCT-116细胞的活力、迁移以及侵袭,促进细胞凋亡,且西黄胶囊联合西妥昔单抗的干预效果优于单独使用西黄胶囊或西妥昔单抗。

金雀异黄酮通过Nrf2/HO-1信号通路减轻皮质神经元低氧/复氧损伤

目的研究金雀异黄酮(GEN)对皮质神经元低氧/复氧(H/R)损伤的影响,并基于核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1(Nrf2/HO-1)信号通路探讨其机制。方法分离并体外培养C57BL/6J小鼠胎鼠(妊娠15 d)皮质神经元,设正常对照(Normal)组、模型(H/R)组、GEN(12.5μmol·L^(-1))组、TBHQ(Nrf2激动剂,10μmol·L^(-1))组、GEN(12.5μmol·L^(-1))+TBHQ(10μmol·L^(-1))组。除正常对照组外,其他组采用低氧(5%CO_(2)+95%N_(2))4 h后复氧(5%CO_(2)+95%空气)24 h的方法制备H/R损伤皮质神经元模型,各组分别于造模前2h给药干预。采用CCK-8法、流式细胞术检测神经元活力和凋亡率,DCFH-DA荧光探针法检测神经元活性氧(ROS)含量,分光光度法检测神经元中丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)]活性,RT-PCR法检测神经元Nrf2、HO-1 mRNA表达,Western blot法检测神经元Nrf2、HO-1、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、激活型Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果与H/R组比较,GEN组、TBHQ组和GEN+TBHQ组皮质神经元活力明显升高、凋亡率明显降低(P<0.05);神经元中ROS、MDA含量明显降低,SOD、GSH-Px活性明显升高(P<0.05);Nrf2、HO-1 mRNA表达量明显升高(P<0.05);Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达量及Bcl-2/Bax比值明显升高,Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达量明显降低(P<0.05)。GEN+TBHQ组对H/R损伤皮质神经元活力、凋亡率、氧化应激指标、Nrf2/HO-1信号通路相关mRNA和蛋白表达的调控作用均明显优于GEN组和TBHQ组(P<0.05)。结论GEN可通过促进Nrf2/HO-1信号通路活化抑制氧化应激损伤和神经元凋亡,对皮质神经元H/R损伤起到保护作用。

督脉隔药灸联合水凝胶多功能复合敷料对压力性损伤大鼠Nrf2/HO-1/NQO1信号通路的影响

目的观察督脉隔药灸联合水凝胶多功能复合敷料对压力性损伤大鼠创面修复及核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2,Nrf2)/血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)/NADPH醌氧化还原酶1(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1)信号通路的影响。方法选取50只SPF级SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、水凝胶敷料组、督脉隔药灸组、联合干预组,每组10只。除假手术组外,其余4组借助压力装置构建压力性损伤大鼠模型。分组干预并记录各组大鼠的压力性损伤修复情况及创面组织病理变化;借助ELISA检测各组大鼠的血清炎性因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6以及氧化应激因子丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)水平;Western blot与RT-PCR检测各组大鼠创面肉芽组织Nrf2、HO-1、NQO1、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白及mRNA的表达水平。结果HE染色结果显示:假手术组皮肤结构未被破坏;模型组创面肉芽组织可见明显的细胞坏死、变性及炎性细胞浸润;干预各组可见创面修复,表现为散在炎性细胞浸润,“气球样”坏死变性明显减少。Masson染色结果显示:假手术组创面皮肤组织胶原纤维较为整齐;模型组创面肉芽组织可见大面积的胶原纤维沉积、紊乱;干预各组可见不同程度的创面修复。与假手术组对比,模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平和创面肉芽组织Nrf2、HO-1、NQO1、MMP-9蛋白及mRNA的表达水平均升高(P<0.05),而创面修复率、血清SOD、GSH-Px水平均下降(P<0.05);与模型组比较,水凝胶敷料组、督脉隔药灸组、联合干预组的血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平均下降(P<0.05),而创面修复率、血清SOD、GSH-Px水平和创面肉芽组织Nrf2、HO-1、NQO1、MMP-9蛋白及m RNA的表达水平均升高(P<0.05),且联合干预组较其他干预组更优(P<0.05)。结论督脉隔药灸可有效促进压力性损伤的创面修复,与水凝胶多功能复合敷料联合使用效果更佳,其机制可能与督脉隔药灸抑制创面炎性反应及氧化应激,并激活Nrf2/HO-1/NQO1信号通路相关。

神经生长因子联合BMSCs-源外泌体通过Keap1/NQO1/Nrf2信号通路缓解脑出血大鼠神经损伤

目的探讨大鼠神经生长因子(rat nerve growth factor,RtNGF)联合骨髓间充质干细胞-源外泌体(BMSCs exosomes)缓解脑出血(intracerebral haemorrhage,ICH)大鼠神经损伤的疗效及其作用机制。方法制备BMSCs exosomes。60只大鼠随机分为假手术(Sham)组,ICH组,ICH+RtNGF组,ICH+BMSCs exosomes组,ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组,每组12只。建立ICH大鼠模型,并给予RtNGF或BMSCs exosomes单独治疗或联合治疗。制备各分组大鼠脑组织石蜡组织切片,并对其进行HE染色。qPCR法测定各分组大鼠脑组织中Keap1/NQO1/Nrf2信号通路蛋白质因子mRNA的相对表达水平。免疫组化(IHC)法测定各分组大鼠脑组织中Keap1/NQO1/Nrf2信号通路蛋白质因子的表达水平。结果与Sham组相比,ICH组大鼠脑组织中存在多处明显的组织腔隙和血凝块。ICH+RtNGF组、ICH+BMSCs exosomes组和ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组均有所改善,且ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组缓解神经损伤效果最好。与Sham组相比,ICH组大鼠脑组织中Keap1,NQO1和Nrf2 mRNA表达水平升高(P<0.05);上述3种蛋白质IHC相对染色评分升高(P<0.05)。与ICH组相比,ICH+RtNGF组、ICH+BMSCs exosomes组和ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组上述检测指标水平降低(P<0.05),且与ICH+RtNGF组或ICH+BMSCs exosomes组相比,ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组上述检测指标水平更低(P<0.05)。结论RtNGF联合BMSCs exosomes治疗ICH大鼠,可通过Keap1/NQO1/Nrf2信号通路降低氧化应激缓解神经损伤。

益气活血托毒方对慢性非细菌性前列腺炎大鼠Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响

目的观察益气活血托毒方对慢性非细菌性前列腺炎(CNP)大鼠Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响,探讨其治疗CNP作用机制。方法采用去势结合雌激素诱导法制备CNP大鼠模型。48只SD大鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组、塞来昔布组和益气活血托毒方组,每组12只。塞来昔布组予塞来昔布混悬液0.035 g/kg灌胃,益气活血托毒方组予益气活血托毒方水煎剂8.64 g/kg灌胃,空白组和模型组灌胃等体积生理盐水,连续28 d。Von Frey纤维丝测痛仪测定大鼠机械痛阈值,HE染色观察前列腺组织病理变化并进行病理评分,化学荧光法检测前列腺组织活性氧(ROS)含量,比色法测定前列腺组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量,Western blot检测前列腺组织Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠机械痛阈值、前列腺指数显著降低(P<0.01);前列腺组织腺腔大小不一,腔内分泌物消失,间质疏松、水肿,有大量纤维组织增生和炎性细胞浸润,病理评分显著升高(P<0.01);前列腺组织ROS、MDA含量显著升高,GSH-Px活性显著降低(P<0.01),Keap1、Nrf2蛋白表达显著降低,HO-1蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05)。与模型组比较,益气活血托毒方组大鼠机械痛阈值显著升高(P<0.01);前列腺组织轻微损伤,有少量纤维增生和炎性细胞浸润,病理评分显著降低(P<0.01,P<0.05);前列腺组织ROS、MDA含量显著降低,GSH-Px活性显著升高(P<0.01),Keap1、Nrf2蛋白表达显著升高,HO-1蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论益气活血托毒方可有效改善CNP大鼠前列腺组织病理形态,提高痛阈值,其作用机制可能与激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路,降低大鼠前列腺组织氧化应激损伤有关。

基于Keap1/Nrf2/HO-1信号通路研究当归醇提物对多囊卵巢综合征大鼠的保护作用

目的使用来曲唑联合高脂饮食建立多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)大鼠模型,探讨当归醇提物(ethanol extract of Angelicae Sinensis Radix,EEA)对PCOS大鼠的保护作用及其作用机制。方法来曲唑联合高脂饮食诱导雌性SD大鼠建立PCOS模型,并用EEA干预。阴道涂片染色、HE染色、酶联免疫吸附法(ELISA)和生化指标检测评价EEA对PCOS大鼠的治疗作用,并通过荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测EEA对Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响。结果阴道涂片和HE染色结果表明,EEA改善了PCOS大鼠动情周期紊乱和卵巢组织病变,ELISA和生化指标检测结果表明EEA可以调节激素紊乱,改善血脂异常;且在模型组中Keap1蛋白和mRNA表达明显上调,Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表达明显下调而经过EEA治疗后Keap1蛋白和mRNA表达明显下调,Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表达明显上调(P<0.05或P<0.01)。结论EEA可以减轻大鼠PCOS,其机制可能是通过促进Keap1/Nrf2/HO-1信号通路,从而抑制氧化应激。

冰菖散通过Nrf2/HO-1信号通路改善APP/PS1阿尔茨海默病小鼠铁死亡及认知功能障碍的研究

目的探讨吸嗅冰菖散通过调节Nrf2/HO-1信号通路来改善阿尔茨海默病(AD)小鼠的铁死亡和认知功能障碍。方法30只APP/PS1小鼠随机分为模型组(APP/PS1组)、冰菖散低剂量组(BCS-L组)和冰菖散高剂量组(BCS-H组),10只同窝阴性小鼠作为空白组(WT组)。WT组和APP/PS1组进行纯水雾化给药处理;BCS-L组和BCS-H组每日雾化给药0.5、1μL冰菖散吸嗅剂,每日10 min,持续2周。给药2周后进行水迷宫实验来判断各组小鼠空间认知能力,水迷宫实验后处死小鼠,取大脑组织进行Aβ_(1-42)免疫荧光和磷酸化Tau蛋白(P-tau)免疫组化及尼氏染色;提取海马组织进行Western blot、qPCR检测Keap1、Nrf2、HO-1、GPX4、SCL7A11、TFRC、DMT1、FTL、FTH1的蛋白和mRNA表达水平;提取大脑组织进行GSH试剂盒检测。结果BCS各组逃避潜伏期缩短,平台所在象限活动时间和穿越平台次数增加。相对于APP/PS1组,BCS各组小鼠的海马CA1区和皮层中的Aβ_(1-42)和P-tau表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。尼氏染色显示,BCS各组神经元排列较为紧密,有较多尼氏体。在海马组织中,相比于未处理的APP/PS1小鼠,BCS各组在Nrf2、HO-1、SLC7A11、GPX4、FTL的蛋白和mRNA表达水平上均有显著提升(P<0.05,P<0.01),BCS-L组FTH1的蛋白和mRNA水平有提升,但无显著意义,同时TFRC、DMT1、Keap1的表达水平显著下调(P<0.05,P<0.01)。此外,BCS各组能有效恢复其大脑中GSH的含量(P<0.05,P<0.01)。结论吸嗅BCS可以改善APP/PS1小鼠认知功能障碍。BCS可以激活Nrf2/HO-1通路,增加GPX4的表达,并通过抑制Keap1来增强Nrf2的转录活性,从而提高SLC7A11的表达并恢复GSH的含量,有效对抗铁死亡。同时,冰菖散还能有效抑制TFRC和DMT1,上调FTL和FTH1的表达,进而维持细胞内铁的稳态平衡,有助于减轻铁死亡对APP/PS1小鼠的影响,可改善AD小鼠的认知功能。

基于Keap1/Nrf2/ARE信号通路探讨高良姜总黄酮对铅诱导HK-2细胞损伤的保护作用

目的 探讨高良姜总黄酮对铅(Pb)诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)细胞损伤的保护作用。方法 体外培养HK-2细胞,MTT法检测不同质量浓度高良姜总黄酮和Pb对HK-2细胞活力的影响。设置对照组、高良姜总黄酮对照组、模型组和高良姜总黄酮组,除对照组和高良姜总黄酮对照组外各组均给予200μmol/L Pb诱导细胞损伤,同时高良姜总黄酮对照组和高良姜总黄酮组给予100μg/mL高良姜总黄酮干预24 h。通过Hoechst 33258荧光染色法联合annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡情况,荧光显微镜法观察Pb诱导及高良姜总黄酮干预对细胞内ROS水平的影响,试剂盒法检测细胞内氧化应激指标ROS、MDA、GSH水平和GSH-Px、CAT、SOD活性,ELISA法检测细胞培养上清液IL-1β、IL-6、TNF-α水平,Western bolt法检测细胞Keap1/Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白及caspase-3蛋白表达。结果 与对照组比较,高良姜总黄酮(12.5~200μg/mL)对HK-2细胞活力没有显著影响。与模型组比较,高良姜总黄酮可减少Pb诱导HK-2细胞的凋亡(P<0.05),减轻细胞皱缩等细胞凋亡形态学变化,上调细胞内SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH水平(P<0.05),降低细胞内MDA、ROS水平(P<0.05),上调Keap1/Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白及caspase-3蛋白表达(P<0.05)。结论 高良姜总黄酮可能通过调控Keap1/Nrf2/ARE信号通路相关蛋白表达,对Pb诱导HK-2细胞损伤起保护作用。

藤黄健骨胶囊通过SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路抑制绝经后骨质疏松大鼠成骨细胞凋亡

藤黄健骨胶囊可以提高绝经后骨质疏松模型鼠的骨密度来改善其骨微结构损害,但具体机制尚未阐明。本文主要研究藤黄健骨胶囊抑制绝经后骨质疏松症大鼠成骨细胞凋亡与SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路的关系,旨在探讨藤黄健骨胶囊对绝经后骨质疏松症的作用机制。采用去卵巢法建立绝经后骨质疏松大鼠模型,分别给予藤黄健骨胶囊(0.09、0.18、0.36 g/kg)灌胃,连续干预8周后进行指标检测。采用TUNEL染色观察股骨组织凋亡情况,结果发现,藤黄健骨胶囊各剂量组股骨组织凋亡阳性细胞和凋亡率均减少(P<0.01)。采用双重免疫荧光染色观察股骨组织成骨细胞中SIRT1、PGC-1α和Nrf2表达水平表达情况,结果发现,藤黄健骨胶囊中、高剂量组成骨细胞PGC-1α表达荧光面积明显升高,各剂量组成骨细胞SIRT1和Nrf2表达荧光面积也明显升高(P<0.01)。qPCR和Western印迹检测股骨组织SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Runx2、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表达水平和翻译水平变化,结果显示,藤黄健骨胶囊中、高剂量组股骨组织Runx2 mRNA水平和蛋白质水平、Nrf2蛋白质水平均明显升高,Caspase-9蛋白质水平明显下降,各剂量组股骨组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2 mRNA水平和蛋白质水平、Nrf2 mRNA水平也均明显升高,而其各剂量组股骨组织Caspase-3mRNA水平、蛋白质水平和Caspase-9 mRNA水平均则明显降低(P<0.01)。综上,本研究初步揭示了藤黄健骨胶囊对绝经后骨质疏松模型鼠成骨细胞凋亡的抑制与SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路有关,SIRT1可能是调控成骨细胞凋亡的重要靶点。

葛根芩连汤对2型糖尿病db/db小鼠胰腺组织PERK/ATF4/CHOP信号通路的影响

目的观察葛根芩连汤对2型糖尿病(T2DM)小鼠胰腺内质网应激的影响,探讨其治疗T2DM的作用机制。方法75只SPF级雄性db/db小鼠随机分为模型组、二甲双胍组和葛根芩连汤高、中、低剂量组,每组15只,15只db/m小鼠作为空白组,给药组分别予相应药物灌胃12周。检测小鼠体质量、空腹血糖(FBG)及糖化血红蛋白(HbA1c),HE染色观察胰腺组织病理变化,TUNEL染色检测胰岛细胞凋亡情况,Western blot检测胰腺组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、p-PERK、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白表达,实时荧光定量PCR检测胰腺组织PERK、ATF4、CHOP mRNA表达。结果与空白组比较,模型组小鼠体质量、FBG和HbA1c含量显著增加(P<0.01);胰腺组织结构不完整,边界模糊,内有空泡,胰岛细胞凋亡明显增加(P<0.01);胰腺组织GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP蛋白表达显著升高(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP mRNA表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,各给药组小鼠体质量、FBG和HbA1c含量显著减少(P<0.05,P<0.01);胰腺组织病理改变有所减轻,胰岛细胞凋亡不同程度减少(P<0.05,P<0.01);葛根芩连汤高、中剂量组和二甲双胍组胰腺组织GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP蛋白表达显著降低(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP mRNA表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论葛根芩连汤可能通过抑制内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路,下调相关基因和蛋白表达,减少胰岛细胞凋亡,保护胰岛细胞功能,延缓T2DM进展。

基于Nrf2-HO-1/GPX4信号轴探讨中药靛玉红衍生物E804抑制肺癌A549细胞增殖和迁移的作用机制

目的 探讨中药靛玉红衍生物E804对非小细胞肺癌(NSCLC)系A549细胞增殖和迁移的影响,并阐明Nrf2-HO-1/GPX4信号轴可能的作用机制。方法 以肺癌A549细胞为细胞模型。采用MTT和细胞划痕实验观察0、10μmol/L E804和10μmol/L E804+不同特异性抑制剂(Nec-1、CQ、Z-VAD、DFO、Fer-1和Lip-1)组细胞的增殖和迁移能力;采用DCFH-DA荧光探针法检测0、2.5、5和10μmol/LE804组细胞内活性氧(ROS)含量,比色法检测二价铁离子(Fe^(2+))含量,分光光度法检测还原型谷胱甘肽(GSH)含量,微量法检测丙二醛(MDA)含量;Western blot法检测0、2.5、5和10μmol/L E804组细胞SLC7A11、Transferrin、GPX4、SLC40A1、Nrf2和HO-1蛋白表达水平。结果 与对照组(0μmol/LE804)比较,2.5、5和10μmol/L E804升高细胞内ROS、Fe^(2+)和MDA水平,降低细胞内GSH含量(P<0.01),同时降低SLC7A11、GPX4、SLC40A1、Nrf2和HO-1蛋白表达水平(P<0.01),升高Transferrin表达水平(P<0.05)。与单独使用10μmol/LE804组比较,细胞凋亡抑制剂(Z-VAD)组和细胞铁死亡抑制剂(DFO、Fer-1和Lip-1)组能够部分逆转E804对A549细胞的增殖和迁移抑制(P<0.01)。结论 E804可抑制A549细胞增殖和迁移,并诱发铁死亡,其机制可能与抑制Nrf2-HO-1/GPX4信号轴有关。

基于Nrf2信号通路探讨黄连解毒汤对阿尔茨海默病小鼠学习记忆的改善作用

目的探究黄连解毒汤对阿尔茨海默病(AD)小鼠学习记忆损伤的改善作用及其机制。方法将12只9月龄雄性C57BL/6J小鼠作为对照组,60只3xTg-AD小鼠随机分成模型组、多奈哌齐组(0.65mg/kg)和黄连解毒汤低、中、高剂量组(1.95、3.9、7.8g/kg),每组12只,对照组和模型组灌胃予以生理盐水,其余各组灌胃予以相应剂量多奈哌齐或黄连解毒汤。给药1个月后,水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力,ELISA法检测小鼠海马组织氧化应激指标(MDA、GSH水平和SOD活性),Westernblot法检测小鼠海马组织细胞核内Nrf2蛋白表达和下游蛋白HO-1、NQO1表达。结果与对照组比较,模型组小鼠逃避潜伏期延长(P<0.05),穿越平台次数、目标象限时间与路程减少(P<0.05),海马组织MDA水平升高(P<0.05),SOD活性和GSH水平降低(P<0.05),HO-1、NQO1、核内Nrf2蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组及多奈哌齐组小鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05),穿越平台次数、目标象限时间与路程增加(P<0.05),海马组织MDA水平降低(P<0.05),SOD活性和GSH水平升高(P<0.05),HO-1、NQO1、核内Nrf2蛋白表达升高(P<0.05);与多奈哌齐组比较,黄连解毒汤中、高剂量组小鼠海马组织MDA水平降低(P<0.05),SOD活性和GSH水平升高(P<0.05),HO-1、NQO1、核内Nrf2蛋白表达升高(P<0.05)。结论黄连解毒汤能改善AD小鼠的学习记忆能力,其可能是通过激活Nrf2信号通路实现的,且高剂量下抗氧化作用最佳。