COUP-TFⅡ在胃癌组织中表达及对胃癌SGC7901细胞中VEGFR3-NRP2轴转录活性的调控

目的:探讨COUP-TFⅡ在胃癌中对淋巴转移相关因子VEGFR3-NRP2轴的调控分子机制。方法:收集2015年3月至2015年8月在滨州医学院附属医院手术切除的60例胃癌组织和相应的癌旁组织及正常胃黏膜活检组织,用免疫组化和qPCR法检测COUP-TFⅡ、VEGFR3和NRP2的表达;培养胃癌细胞SGC7901和BGC823,构建过表达和siRNA-COUP-TFⅡ质粒后转染SGC7901细胞,用WB和qPCR检测转染后SGC7901细胞中COUP-TFⅡ、VEGFR3、NRP2的表达,用免疫共沉淀(CHIP)和双荧光素酶报告基因实验验证COUP-TFⅡ与VEGFR3-NRP2轴的靶向关系。结果:免疫组化检测显示,VEGFR3、NRP2、COUP-TFⅡ在胃癌组织中呈高表达(P<0.01);q PCR结果显示,与癌旁组织和正常组织相比,胃癌组织VEGFR3、NRP2和COUPTFⅡ的mRNA呈高表达(P<0.05或P<0.01);WB和qPCR法结果显示,与对照组相比,过表达COUP-TFⅡ组SGC7901细胞中COUP-TFⅡmRNA和蛋白水平表达均显著升高(均P<0.01);敲减组SGC7901细胞中COUP-TFⅡmRNA和蛋白水平均显著下降(P<0.05或P<0.01),且VEGFR3和NRP2 mRNA水平也均显著下降(均P<0.01);CHIP结果显示,SGC7901和BGC823细胞中COUP-TFⅡ抗体的免疫共沉淀物中含有VEGFR3和NRP2启动子DNA序列;双荧光素酶报告基因实验结果显示,COUP TFⅡ表达水平与VEGFR3和NRP2表达水平呈正相关。结论:COUP-TFⅡ在胃癌组织中高表达且对VEGFR3-NRP2轴存在正性调控作用,且在胃癌中高表达,COUP-TFⅡ可能为胃癌治疗的新靶点。

结肠癌组织NRP2的表达与淋巴结转移的关系

目的:探讨结肠癌组织中NRP2的表达在淋巴管生成和转移中的作用。方法:采用免疫组化法、RT-PCR法检测结肠癌组织中NRP2和VEGF-C的表达,以及结肠癌组织淋巴管的免疫组化标记和微淋巴管密度(MLD)计数。结果:结肠癌组织周围区域(48.8±23.5)、表浅区域(24.6±10.1)和肿瘤中心(11.3±7.7)MLD存在显著差异(P<0.05);结肠癌组织NRP2的mRNA水平为0.87±0.26,高于正常组织0.38±0.12,转移组的mRNA水平为1.12±0.25,也高于非转移组的0.76±0.19(P<0.01)。NRP2表达定位于结肠癌细胞浆和部分淋巴管内皮细胞浆,阳性率为34.8%;其表达与肿瘤边缘及标记部位MLD呈正相关(r=0.432,P<0.01),并与肿瘤的淋巴结转移、分化程度、Dukes分期和浸润深度相关(P<0.05),与VEGF-C的表达亦呈正相关(r=0.606,P=0.001)。结论:NRP2表达可能对结肠癌局部淋巴管生成及淋巴结转移起到重要的作用。

Nrp1、Nrp2及SEMA3F在口腔癌组织及TCa、ACC细胞系中的表达及其可能的作用

目的研究SEMA3F及其受体Nrp1和Nrp2在口腔癌组织和细胞(ACC2,ACCM和TCa)中的表达情况,并推测其在口腔癌生成中的可能意义。方法应用RT-PCR和Western bloting以及免疫组化法检测SEMA3F、Nrp1及Nrp2在口腔癌(ACC2,ACCMand TCa)组织和细胞中的表达情况。结果在所有口腔癌组织和癌细胞中均可检测到Nrp1和Nrp2的表达,但Nrp2相对表达较弱。Western bolting、RT-PCR提示Nrp1呈高表达,Nrp2及SEMA3F均表达较低。在免疫组织化学中显示癌及癌周组织中Nrp1均呈高表达,且癌巢中的表达明显高于癌间隙组织,Nrp2及SEMA3F呈较弱表达。结论提示在肿瘤的发展进程中,Nrp1可能对肿瘤本身的发生,增殖及肿瘤的血管生成均可能起到了重要的作用。

NRP2表达抑制对结肠癌细胞LoVo移植瘤淋巴管生成和转移的影响

目的:探讨抑制Neuropilins-2(NRP2)基因表达对结肠癌淋巴管生成和转移的影响。方法:采用RNA干扰(RNAi)下调结肠癌LoVo细胞株NRP2表达,接种NRP2 RNAi的LoVo细胞株于裸鼠,建立裸鼠结肠癌结肠原位移植瘤模型,分别观察移植后4、6、8和12周裸鼠结肠原位移植瘤淋巴管生成以及转移的情况。结果:成功建立结肠癌裸鼠原位移植瘤动物模型。下调结肠癌LoVo细胞株NRP2表达能显著降低裸鼠结肠原位移植瘤的淋巴管密度以及远处转移。结论:抑制NRP2表达可以抑制结肠癌的淋巴管生成和转移,它将是一个潜在的肿瘤治疗靶点。

NRP2及miR-486-5p在胃癌中的表达及临床意义

目的:检测神经纤毛蛋白-2(neuropilin-2,NRP2)和mi R-486-5p在胃癌组织中的表达,探讨其与胃癌淋巴结转移的关系。方法:收集65例胃癌组织及其配对癌旁正常粘膜组织,免疫组织化学法检测组织中NRP2的表达,real-time PCR检测mi RNA-486-5p的表达,免疫组织化学法检测D2-40标记的微淋巴管密度(microlymphatic density,MLD),统计分析NRP2、mi R-486-5p的表达与MLD相关性。结果:免疫组化提示NRP2在肿瘤中表达增高(78.5%vs.29.2%,χ2=16.046,P=0.000),且与淋巴结转移密切相关(χ2=7.222,P=0.007)。real-time PCR结果显示肿瘤组织mi R-486-5p表达明显下调(0.39±0.16 vs.1.00±0.06,P=0.000),NRP2的表达水平与MLD呈正相关(r=0.384,P=0.015),mi R-486-5p的表达水平与MLD呈负相关(r=-0.755,P=0.000)。结论:NRP2和mi R-486-5p与胃癌发生发展密切相关,有望成为胃癌治疗的新靶点。

Adv-shRNA抑制NRP2表达对胃癌SGC7901细胞增殖的影响

目的通过特异性抑制胃癌细胞株SGC7901中神经纤毛蛋白2(NRP2)基因的表达,检测RNA干扰片段对SGC7901细胞增殖能力的影响。方法将NRP2的特异性RNA干扰腺病毒载体转染至胃癌细胞SCG7901 72 h后荧光显微镜观察转染情况;采用RT-PCR法检测转染后NRP2基因mRNA表达情况;MTT法检测胃癌细胞增殖情况;Western印迹检测转染后NRP2蛋白表达情况。结果成功将NRP2-shRNA重组腺病毒载体转染至胃癌细胞SGC7901。各重组腺病毒转染组NRP2 mRNA水平均低于阴性对照组和空白组,其中以NRP2-shRNA-3抑制效应最强。阴性对照组与空白组细胞增殖迅速,两组间无显著差异(P>0.05),实验组经腺病毒载体转染后细胞增殖程度显著减少,与前两组相比有显著差异(P<0.05)。阴性对照组与空白组NRP2蛋白表达量明显高于实验组(P<0.01),而阴性对照组与空白组之间无显著差异(P>0.05)。结论重组腺病毒载体NRP2-shRNA可有效抑制胃癌细胞SCG7901中NRP2基因的mRNA和蛋白的表达,并在一定程度上抑制癌细胞增殖,可作为动物实验的理论基础和前期条件。

VEGFC/D-VEGFR3/NRP2轴通路相关分子在肿瘤及其淋巴道转移时的变化与意义

本文综述VEGFC/D-VEGFR3/NRP2轴通路相关分子Furin-like酶、CNTN1、Prox1、LYVE-1、Podoplanin、SOX18、SDF1、CXCR4等的结构功能,在不同部位、不同类型、不同发展阶段的肿瘤及其淋巴道转移过程中的变化规律和细胞内外信号系统转导、执行、合成等网络调控特点以及肿瘤细胞-淋巴管内皮细胞相互作用及其生物学行为影响,特别是在肿瘤发生发展和淋巴道转移分子机制中的意义。

结肠癌中相关miRNA对NRP2调控的预测及鉴定

目的:预测可能调控神经纤毛蛋白2(neuropilin-2,NRP2)的微小RNA(microRNA,miRNA),鉴定其对NRP2的调控作用及可能的调控机制.方法:使用生物信息学软件预测可能调控NRP2的miRNA,选择可能性最大的miRNA-486-5p进一步研究,构建miRNA-486-5p过表达质粒,采用脂质体法将质粒转染入人结肠癌细胞株SW620,实时定量PCR(qRT-PCR)验证miRNA-486-5p的表达丰度,Western blot检测NRP2的表达,双荧光素酶实验验证miRNA-486-5p对NRP2的调控机制.结果:生物信息学技术预测共有25条miRNA可能调控NRP2的表达,结合文献选择miR-486-5p进一步研究;miR-486-5p过表达质粒转染SW620细胞后,表达丰度升高,NRP2蛋白表达明显下调,双荧光素酶实验证实miRNA-486-5p可与NRP2 mRNA 3'非转录区(3'untranslated region,3'UTR)直接结合,从而发挥对NRP2转录后翻译的抑制作用.结论:miRNA-486-5p可调控的NRP2的表达,其作用机制是通过结合NRP2 3'UTR而抑制NRP2 mRNA的正常翻译.

淋巴管内皮细胞受体NRP2研究新进展

NRP2是新近发现的淋巴管内皮细胞受体,其能与血管内皮细胞生长因子VEGFC/D结合,诱导肿瘤原有及新生淋巴管生成、分化和重构,促进肿瘤细胞向淋巴道迁徙、侵袭和转移。NRP2受体不仅是连接、启动、激活细胞外配体和细胞内信号通路的中枢结点,更是反映不同解剖学部位、不同组织学类型、不同发生发展阶段肿瘤特性的良好指标。了解NRP2受体结构功能的生化意义,确定其在VEGFC/D-NRP2反应轴中的核心地位,分析其与VEGFR3、NRP1等同类受体之间的相互关系,观察其在肿瘤淋巴管生成和淋巴道转移时的表达规律,阐明其可能涉及的分子生物学机制,具有重要意义。

超声检测老年前列腺癌患者血流分级与术后组织中NRP1和NRP2的关系

临床常通过血清学中前列腺特异抗原（PSA）等肿瘤相关标志物的检测以早期发现肿瘤，但由于其特异性差，使其在临床中的应用并不理想。研究显示前列腺癌发生中血管生成相对于正常组织来说明显增多。临床上观察血流最简便而无创的是彩色多普勒超声检测血流分级。神经纤毛蛋白（NRP）1和NRP2是内皮细胞表面的一种受体，其对肿瘤的进展和血管形成均有促进作用。在超声检测中的血流分级提示器官内的血液流量，由于超声检测的无创性，早期通过超声将血流分级与肿瘤组织中的NRP1和NRP2联系起来，可能对早期判断肿瘤的生物学行为有一定意义。本文关注血流分级与术后组织中NRP1和NRP2的关联性。

VEGF、NRP2、MVD、LN在胃癌中的表达

胃癌（GC）是发生在胃上皮组织的恶性肿瘤,在全球每年新发胃癌90余万例,占所有新发癌症的9%,仅次于肺癌、乳腺癌和肠癌,居第4位,每年约有70余万人因胃癌死亡,居癌症死亡原因的第2位[1-2]。胃癌在中国是常见的恶性肿瘤之一,在消化道肿瘤中其死亡率最高[3]。总体5年生存率〈20%,大部分的初治患者就诊时已为中晚期,并出现局部进展或远处转移[4]。目前,胃癌的治疗主要是采取手术切除为主。

NRP2研究进展

NRP2是一种非酪氨酸激酶受体,在细胞迁移和免疫系统中发挥着重要的作用,可促进肿瘤细胞的侵袭、迁移和转移。根据近期的研究进展,文章综述了NRP2在肿瘤、细胞迁移和免疫系统中的表达规律,并阐述了其可能涉及到的信号通路与分子机制。

miRNA-486-5p对胃癌细胞SGC7901中NRP2表达的影响

目的:预测并鉴定miRNA-486-5p在人胃癌细胞SGC7901中的靶基因及其表达。方法:采用生物信息学技术预测miRNA-486-5p的作用靶点,构建miRNA-486-5p过表达质粒(GV214-miR)并转染入SGC7901细胞(SGC7901-miR)中,以空质粒转染SGC7901细胞(SGC7901-miR-NC)为阴性对照,以SGC7901细胞为空白对照。Real-time PCR检测转染细胞中miRNA-486-5p及其靶基因神经纤毛蛋白2(neuropilin-2,NRP2)mRNA的表达,Western blotting检测NRP2的表达,双荧光素酶实验验证miRNA-486-5p对NRP2基因的调控机制。结果:经生物信息学预测,选择与胃癌生物学行为密切相关的NRP2作为miRNA-486-5p的靶基因。与空白组相比,GV214-miR转染后的SGC7901细胞miRNA-486-5p表达显著上调[(8.21±1.18)vs(1.02+0.26),P<0.01],NRP2 mRNA表达无明显变化(P>0.05),而NRP2蛋白表达则明显下调[(0.36±0.06)vs(0.76±0.05),P<0.05],双荧光素酶实验证实miRNA-486-5p可与NRP2 mRNA 3'-UTR直接结合,从而发挥对NRP2转录后翻译的抑制作用。结论:miRNA-486-5p在胃癌细胞SGC7901中可直接作用于NRP2 mRNA 3'UTR,从而抑制其表达。

喉癌组织中SEMA3F与NRP2的表达及临床价值

目的探讨喉癌组织中神经轴突导向因子(SEMA3F)、神经菌毛蛋白2(NRP2)的表达及临床意义。方法选取2016年3月~2018年3月我院收治的82例喉癌患者为研究对象,用实时定量PCR法检测癌及癌旁组织中SEMA3F、NRP2 mRNA的表达。以癌组织中SEMA3F、NRP2 mRNA表达的平均数为界,将研究对象分别分为SEMA3F高、低表达组及NRP2高、低表达组。分析SEMA3F、NRP2的表达与临床病理特征关系。Pearson线性相关分析SEMA3F与NRP2表达的相关性。Kaplan-Meier生存分析(Log-Rank检验)癌组织不同SEMA3F、NRP2表达与喉癌患者的生存预后差异。多因素COX回归分析影响喉癌患者生存预后的危险因素。结果与癌旁组织相比,癌组织SEMA3F mRNA表达明显降低,NRP2 mRNA表达明显升高(均P<0.05)。喉癌组织中SEMA3F与NRP2的表达呈显著负相关(r=-0.561,P<0.001)。SEMA3F、NRP2 mRNA的表达与肿瘤临床分期及淋巴结转移有关(均P<0.05)。生存分析结果表明,喉癌组织中SEMA3F低表达、NRP2高表达喉癌患者3年总体生存率明显较差(均P<0.05)。多因素COX回归分析结果喉癌组织中SEMA3F低表达、NRP2高表达、肿瘤Ⅲ~Ⅳ期及淋巴结转移是喉癌患者不良预后的危险因素。结论喉癌中SEMA3F表达降低,NRP2表达增高,均与肿瘤分期及淋巴结转移有关,可能是喉癌预后新的标志物。

NRP2的表达与晚期胃癌含铂方案化疗敏感性及其预后的相关性分析

目的探讨分析神经纤毛蛋白-2(NRP2)的表达与晚期胃癌(GC)含铂方案化疗敏感性及其预后的相关性。方法随机选取2015年1月至2016年1月在我院就诊的300例GC晚期患者作为研究对象,采用免疫组织化学法检测300例应用含铂方案化疗的晚期GC肿瘤组织中NRP2表达,并分析NRP2表达与化疗反应率的关系、NRP2表达对生存期的影响。结果 (1)NRP2低表达患者化疗反应率高于高表达者(χ2=17.083,P<0.001),NRP2表达为化疗反应率的独立预测因素(OR=3.103,95%CI:1.320~7.290,P=0.009);(2)NRP2低表达患者较高表达患者PFS(4.5/9.8个月,χ2=10.852,P=0.001)及OS(10.8/8.7个月,χ2=13.267,P<0.001)更长。NRP2高表达(r=2.146,P<0.001)与后续未进行含铂方案化疗(r=3.014,P<0.001)均为OS独立预测因素。结论 NRP2在胃癌中高表达,与晚期GC含铂联合化疗反应率和生存期具有相关性,NRP2表达可能成为预测晚期GC行含铂方案化疗敏感性以及预后的指标之一。

RNA干扰NRP2基因表达对胃癌细胞SGC7901裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:探讨特异性抑制NRP2基因表达对人胃癌细胞SGC7901裸鼠移植瘤生长及淋巴管新生的影响。方法:采用小RNA干扰方法,构建shNRP2质粒,稳定转染入SGC7901细胞株,Westen blot检测转染前后NRP2蛋白的表达。建立人胃癌细胞SGC7901裸鼠移植瘤模型,随机分为shNRP2组(实验组)、shCon组(HK阴性对照组)和正常对照组,观察移植瘤的生长情况。6周后处死裸鼠,免疫组化检测NRP2蛋白的表达及微淋巴管密度(Micro-vessel density,MLD)。结果:成功构建shNRP2质粒,与另两组比较,shNRP2组细胞NRP2蛋白表达明显降低,且移植瘤组织生长、NRP2表达及MLD明显受抑制。结论:抑制NRP2基因的表达,可以抑制胃癌裸鼠移植瘤的生长及淋巴管的形成,NRP2基因有可能成为一个潜在的胃癌生物治疗靶点。

RNA干扰Neuropilins-2基因真核表达载体的构建及其鉴定

目的构建Neuropilins-2(NRP2)基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体。方法以NRP2为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构件重组体,根据GenBank数据库提供的NRP2基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。重组pGenSil-NRP2载体转染LOVO细胞48 h,收获细胞,采用Western blotting检测其NRP2蛋白表达。结果经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体构建成功。重组体pGenSil-NRP2转染LOVO细胞48 h后NRP2蛋白表达显著降低。结论利用RNAi技术可成功构建抑制NRP2表达的小干扰RNA重组体。

NPRL2调控去势抵抗型前列腺癌对奥拉帕尼的敏感性

目的探讨NPRL2在改善去势抵抗型前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)对Olaparib敏感性的作用。方法收集良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)、普通前列腺癌(prostate cancer,PCa)和CRPC患者手术标本进行NPRL2的免疫组化染色,观察NPRL2在上述组织中的表达差异。Western blot检测正常前列腺上皮细胞RWPE-1、前列腺癌细胞LNCaP和耐恩杂鲁胺的去势抵抗型前列腺癌细胞LNPER中NPRL2蛋白的表达情况。通过慢病毒转染到CRPC细胞建立NPRL2的过表达和干扰,实时定量荧光PCR(qPCR)和Western blot验证NPRL2过表达和干扰效率,蛋白免疫印迹检测ATM蛋白表达。CCK-8法检测细胞增殖和细胞毒性,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室侵袭和迁移实验检测细胞侵袭转移。结果免疫组化结果显示NPRL2在CRPC组织中呈现高表达。Western blot结果显示NPRL2在RWPE-1细胞中低表达,在LNCaP和LNPER细胞中高表达,并成功构建过表达和干扰NPRL2的稳定株,q PCR及Western blot结果显示慢病毒转染能明显增高和降低NPRL2的mRNA和蛋白水平(P <0. 01)。CCK-8、流式细胞术和Transwell实验结果显示,与阴性对照比较,沉默NPRL2联合Olaparib能明显抑制细胞生长、阻止细胞侵袭转移和促进细胞凋亡(P <0. 01)。NPRL2与ATM表达呈正相关,NPRL2过表达联合Olaparib显著增加ATM表达。结论沉默NPRL2可增加CRPC细胞对Olaparib的敏感性。

喉鳞癌患者术后组织中神经纤毛蛋白1、2的表达及对血管生成的作用

目的观察喉鳞癌组织中神经纤毛蛋白(NRP)1、2的表达特点,关注二者对肿瘤中CD34阳性的血管生成的作用。方法收集79例喉鳞癌标本作为观察组,收集53例正常喉黏膜组织作为对照组,应用免疫组织化学技术检测二组中NRP1、NRP2和CD34的表达,分析其在不同临床特征中的表达差别及相关性。结果喉鳞癌中NRP1、NRP2表达的阳性率和CD34标记的微血管密度(MVD)明显高于对照组,观察组中NRP1、NRP2表达的阳性率和MVD与肿瘤体积、淋巴结转移、淋巴结转移数量及Ki67的表达密切相关,线性相关分析显示NRP1和MVD、NRP2和MVD具有正相关性,生存分析显示NRP1、NRP2和MVD与患者的预后相关。结论 NRP1、NRP2和MVD高表达在喉鳞癌的发生发展中具有重要作用,NRP1、NRP2具有促进CD34阳性的血管生成的作用,联合检测NRP1、NRP2和MVD可能与喉鳞癌的预后密切相关。

VEGF-C基因RNA干扰真核表达载体的构建及其效果鉴定

目的:构建VEGF-C基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体。方法:以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果:经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论:利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。