猪流行性腹泻病毒非结构蛋白NSP15抑制细胞焦亡的分子机制研究

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)及其NSP15蛋白对细胞焦亡的影响及初步的分子作用机制,本研究将表达pGSDMD-p30的质粒转染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞),24 h后将PEDV感染该细胞,于感染后12 h和24 h分别收集细胞上清液和细胞,采用LDH试剂盒测定各时间点细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放比例;采用qPCR检测细胞中GSDMD mRNA的转录水平。结果显示,各时间点,转染表达pGSDMD-p30质粒的IPEC-J2细胞中LDH的释放比例均极显著升高,表明细胞发生焦亡,且与转染p GSDMD-p30质粒的细胞相比,PEDV感染的细胞中LDH的释放比例及GSDMD mRNA的转录水平均极显著降低。将表达pGSDMD-p30的质粒分别与不同剂量的PEDV-NSP15质粒共转染HEK293T细胞(pGSDMD-p30+NSP15组);将表达Caspase-1、pGSDMD和表达NSP15的质粒分别共转染HEK293T和IPEC-J2细胞(Caspase-1+pGSDMD+NSP15组)。上述细胞于24 h后均测定各组细胞上清液中LDH的释放比例。结果显示,与pGSDMD-p30组(共转染表达pGSDMD-p30与空载体的细胞)相比,pGSDMD-p30+NSP15组HEK293T细胞及IPEC-J2细胞中LDH的释放比例均显著降低;与Caspase-1+pGSDMD对照组细胞相比,Caspase-1+pGSDMD+NSP15组细胞中LDH的释放比例极显著降低。上述结果表明,NSP15在不同细胞中均可以抑制GSDMD-p30及GSDMD+Caspase-1两种方式引起的细胞焦亡,提示PEDV可能通过NSP15抑制细胞的焦亡。将自噬抑制剂3-MA和蛋白酶体途径抑制剂MG132分别加入不同剂量的NSP15质粒与MYC-pGSDMD质粒共转染的HEK293T细胞中,6 h后采用western blot检测细胞中GSDMD的表达水平;将上述质粒共转染HEK293T细胞,24 h后通过qPCR检测细胞中GSDMD mRNA的转录水平。结果显示,随着NSP15转染剂量的增加,细胞中GSDMD的表达水平逐渐减少,加入3-MA和MG132并不影响GSDMD的表达水平;相比于共转染空载体和NSP15质粒的对照组,MYC-pGSDMD+NSP15组细胞中GSDMD mRNA的转录水平极显著降低。上述结果表明,PEDV NSP15降解GSDMD的过程不是通过自噬和蛋白酶体途径实现的。将4个核酸内切酶活性位点突变的NSP15质粒分别与pGSDMD-p30或pGSDMD质粒共转染HEK293T细胞,24 h后采用LDH试剂盒测定各组细胞上清中LDH的释放比例;采用western blot检测各组细胞中GSDMD的表达水平。结果显示,与p30组相比,H^(226)、H^(241)和K^(282)突变组细胞上清中LDH的释放比例均无显著变化,而D^(265)突变组细胞上清中LDH的释放比例极显著降低;H^(226)、H^(241)和K^(282)突变组细胞中GSDMD的表达水平与阴性对照组细胞中GSDMD的表达水平相当,而D^(265)突变组细胞中GSDMD的表达水平明显减少。上述结果表明,PEDV通过其NSP15蛋白抑制各种细胞的细胞焦亡,且本研究首次证明该蛋白通过其核酸内切酶活性位点H^(226)、H^(241)和K^(282)降解GSDMD并抑制细胞焦亡,为PED的治疗和开发抗PED的药物提供参考。

传染性支气管炎病毒nsp4和nsp15通过调节NF-κB和IRF3信号通路抑制Ⅰ型干扰素表达

为探究传染性支气管炎病毒(IBV)的非结构蛋白在其抑制Ⅰ型干扰素表达作用中的机理,本试验利用IBV流行毒株感染原代鸡胚肾细胞,通过添加poly(I∶C),检测细胞中Ⅰ型干扰素的表达水平,并构建IBV流行毒株各非结构蛋白真核表达载体,转染鸡胚成纤维细胞(DF-1)后转染poly(I∶C),检测细胞中IFN-β、NF-κB以及IRF3的mRNA表达水平。结果显示,IBV JS株能显著抑制由poly(I∶C)诱导的I型干扰素的表达,且nsp3、nsp4、nsp7、nsp14以及nsp15在此过程中发挥重要作用,nsp4和nsp15可通过抑制上游信号通路中的NF-κB或IRF3的表达来抑制IFN-β的转录,拮抗I型干扰素反应。本试验结果可为深入研究IBV的致病机理及其逃避宿主免疫应答的机制提供理论基础。

PEDV nsp15基因真核表达载体的构建及蛋白的表达

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)含有一种名为Nsp15的非结构蛋白,为了研究Nsp15蛋白在侵染宿主细胞时产生的作用,成功构建了PEDV Nsp15基因的真核表达载体。通过PCR技术扩增Nsp15基因片段,经双酶切连接到pCMV-Myc载体上,酶切鉴定及测序结果证实PEDV Nsp15基因成功克隆到pCMV-Myc载体中,并将重组质粒命名为p CMV-Myc-Nsp15。将重组质粒pCMV-Myc-Nsp15转染至IPEC-J2细胞中,利用Western Blot和间接免疫荧光技术检测pCMV-Myc-Nsp15的表达以及定位情况。结果显示,pCMV-Myc-Nsp15在IPEC-J2细胞中成功表达,并且在胞质胞核均匀分布。为进一步研究PEDV Nsp15蛋白的功能奠定基础。

通过反向遗传操作技术构建传染性支气管炎病毒nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组毒株

传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)属于γ属冠状病毒,其核酸内切酶nsp15(Non-structural protein 15)的功能尚未得到解析。为探讨nsp15在IBV感染和复制过程中的作用,本研究对nsp15的核酸内切酶活性中心H238进行突变,通过体外连接技术构建重组病毒rIBV-nsp15-H238A,并对病毒滴度、感染复制能力和生长曲线进行鉴定。方法如下:将IBV Beaudette-R毒株的基因组分成5个片段克隆到质粒载体,并在每个片段加上Bsa I或Bsm BI限制性酶切位点。通过质粒载体进行扩增后,通过酶切获得cDNA片段,在体外连接成全长基因组cDNA,转录出全长基因组RNA,跟N的转录本一起电击转染到Vero细胞,拯救出重组病毒rIBV和rIBV-nsp15-H238A。利用空斑试验检测比较rIBV和rIBV-nsp15-H238A的病毒滴度和空斑大小,鉴定nsp15核酸内切酶活性对IBV感染性的影响。结果显示,rIBV-nsp15-H238A的病毒滴度为2.7×10^(6)PFU/mL,比rIBV的病毒滴度(9.4×10^(6)PFU/mL)低3倍还多,且rIBV-nsp15-H238A空斑孔径远小于rIBV,说明rIBV-nsp15-H238A复制和扩散能力远低于rIBV。利用TCID_(50)检测病毒的生长曲线,结果表明在感染后0~24h,rIBV-nsp15-H238A的生长曲线均低于rIBV。由此可见,IBV nsp15H238核酸内切酶活性位点对IBV的感染复制起着重要作用。本研究通过反向遗传操作构建nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组病毒,为研究nsp15的功能提供了一个有力的工具。

带TRS基序突变的新型冠状病毒威胁更大

目的研究冠状病毒转录调控序列(TRS)基序突变,为深入研究冠状病毒的爆发、传播规律以及开发减毒活疫苗等提供理论基础。方法采用进化与分子功能联合分析法,对公开的全部套目病毒基因组数据进行分析。结果冠状病毒基因组内的前导转录调控序列(TRS-L)通常由其5’端非编码区内的前60~70个核苷酸残基组成,长度不同的基因体转录调控序列(TRS-B)位于除ORF1a和1b外的其它基因紧邻的上游,每个冠状病毒基因组的TRS-L和TRS-B共有一段特定的一致性序列,即TRS基序,TRS基序中出现的碱基变化叫做TRS基序突变。TRS基序突变如果发生在TRS-L或多个TRS-B中,会形成超级减毒株。超级减毒株的扩散,可引起无症或轻症感染者增多,潜伏时间长,以及漏检率上升等问题,对SARS-CoV-2的防控提出新的挑战。超级减毒株还会增大与人类长期共存的概率,将长期威胁人类健康。Delta突变株与此前出现的突变株有显著不同,如果不高度重视,可能引起大规模传播。带TRS基序突变的Delta突变株已经在新加坡出现并有扩散趋势,因此新加坡,甚至东南亚可能形成下一波疫情的传播中心。结论各种SARS-CoV-2突变株都将产生TRS基序突变,只有带TRS基序突变的超级减毒株,才能最终失去跨物种传播和大爆发的能力。

禽传染性支气管炎病毒拮抗JAK-STAT信号通路的研究

已有报道显示冠状病毒拮抗干扰素下游JAK-STAT信号通路,然而,关于传染性支气管炎病毒(IBV)对JAK-STAT信号通路的拮抗,鲜有报道。本文通过Western blot试验,证实IBV感染抑制STAT1和STAT2的磷酸化;间接免疫荧光实验证实IBV和nsp15核酸酶活性缺陷型重组病毒rIBV-nsp15-H238A均能抑制STAT1的核转位,说明IBV感染确实拮抗JAK-STAT信号通路,且nsp15核酸酶活性不是必需的。进一步实验证明,IBV编码的核酸内切酶nsp15,能够抑制内源性和外源性的STAT1表达,并且nsp15的核酸酶活性位点及其三聚化能力都是必需的。由于nsp15缺陷型毒株rIBV-nsp15-H238A能够跟野生型IBV一样拮抗JAK-STAT信号通路,推测IBV还编码其他蛋白,作用于JAK-STAT信号通路,需要进一步对病毒蛋白进行筛选和研究。

沼液与园林废弃物共堆肥下的氮素转化及其微生物作用机制

我国每年产生大量的园林废弃物,外加尿素和菌剂的堆肥方式使其可以被大量处置和循环利用,但该方法存在严重的氮素损失和环境问题。沼液含有一定的氮源和微生物,理论上可以作为尿素和菌剂的替代物从而减少氮素损失。本研究设置了沼液+园林废弃物(GB)、沼液+园林废弃物+尿素(GBU)和沼液+园林废弃物+尿素+菌剂(GBUM)处理,研究堆肥过程的腐熟、氮素转化及损失情况。结果表明:与GBU和GBUM处理相比,GB处理的高温期更长且更稳定,同时具有更适合堆肥的pH和电导率(EC)以及最高的发芽指数(221.8%)。GB处理NH_(3)和N_(2)O的排放速率分别为2.59 mg·kg^(-1)·d^(-1)和3.65μg·kg^(-1)·d^(-1),比GBU处理分别降低99.0%和50.0%,比GBUM处理分别降低99.4%和40.7%。δ^(18)O和δ^(15)NSP双同位素图谱技术分析显示,GB和GBU处理以反硝化作用为主,且GB处理反硝化作用贡献高于GBU处理,而GBUM处理以硝化作用为主;GB处理的N_(2)O还原程度(83.7%)大于GBU和GBUM处理。可见,与GBU和GBUM处理相比,GB处理的腐熟度更好、氮素损失更低,并通过增强反硝化作用的N_(2)O还原过程减少了N_(2)O排放。综上,沼液与园林废弃物可以在不受C/N与微生物的限制下直接共堆肥,这种方式既保护了环境,又节约了资源,在实际生产中可以实现废弃物的循环再利用。