烟草绿原酸合成关键基因NtHQT1的克隆及表达分析

绿原酸(Chlorogenic acid,CGA)是烟叶中含量最高的多酚类物质,羟基肉桂酰辅酶A奎尼羟基肉桂转移酶(Hydroxycinnamoyl-Co A quinate hydroxycinnamoyl transferase,HQT)是植物绿原酸合成代谢途径中的关键酶。为研究HQT基因在烟草绿原酸合成中的作用机制,通过同源克隆技术从烟草中克隆到一个新的HQT基因,命名为Nt HQT1。生物信息学和激素处理后基因表达模式分析结果表明:Nt HQT1 c DNA全长1 305 bp,编码435个氨基酸,Nt HQT1定位在细胞质中,属于疏水性蛋白,其二级结构主要是螺旋和无规则卷曲;茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,Me JA)、生长素(3-Indoleacetic acid,IAA)、独角金内酯类似物(GR24)、细胞分裂素(6-Benzylaminopurin,6-BA)和赤霉素(Gibberellic acid,GA)能明显上调Nt HQT1基因的表达,脱落酸(Abscisic acid,ABA)对基因表达没有明显作用,预示Nt HQT1基因在烟草生长发育和抗病等生物学过程中发挥重要作用。

基于CRISPR/Cas9技术的烟草NtHQT2基因敲除及功能分析

羟肉桂酰辅酶A奎宁酸羟肉桂酰转移酶(hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase,HQT)是绿原酸合成代谢通路的关键酶。从普通烟草(Nicotiana tabacum L.)中克隆到1个NtHQT的同源基因,并命名为NtHQT2。氨基酸序列比对和遗传进化分析结果显示,NtHQT2具有HQT蛋白保守的HTLSD和DEFEG基序,并且在进化上与烟草及其他茄科植物HQT属于同1个分支。通过qRT-PCR分析NtHQT2基因在烟草不同组织的表达模式发现,NtHQT2基因在烟草根、茎、叶、腋芽和花中均有表达,但在叶片中的表达量较高。进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对NtHQT2基因进行定向敲除,获得了3种类型的T0代基因编辑植株,均能导致NtHQT2蛋白的翻译错误。通过测定T2代NtHQT2基因编辑烟株叶片中绿原酸含量,发现编辑烟株比对照K326烟株绿原酸含量显著下降,说明NtHQT2基因正向调控绿原酸的合成。

烟草HQT基因超量表达对次生代谢物质一咖啡酰奎尼酸和黄酮醇合成的影响

【背景和目的】一咖啡酰奎尼酸(CQAs)和黄酮醇是植物重要的苯丙烷类次生代谢物质,对人体健康有益,然而在烟叶中含量甚微。【方法】NtHQT是烟草中调控一咖啡酰奎尼酸合成最后一步的一种酰基转移酶,为验证NtHQT是否参与黄酮醇的合成,本研究构建了pCXSN::NtHQT超量表达载体,转化野生烟草三生烟。【结果】转基因烟叶中一咖啡酰奎尼酸的含量最高可提高10.34倍,芦丁和山奈酚芸香糖苷含量最高可分别提高17.83和16.97倍,而生长表型与野生型烟草没有明显差异。【结论】NtHQT基因在不影响烟草的生长发育的前提下,不仅参与调控一咖啡酰奎尼酸的合成,也具有正向调控黄酮醇的生物合成的功能,提高烟叶中芦丁和山奈酚芸香糖苷含量。