烟草NtMYB4a基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选

为探究NtMYB4a是否与其他蛋白质发生互作,并共同影响烟草次生代谢产物的合成和响应非生物胁迫,通过构建NtMYB4a基因酵母双杂交诱饵载体,从烟草cDNA文库中筛选出与NtMYB4a互作的候选蛋白,并利用实时荧光定量PCR初步验证低温胁迫下候选蛋白和NtMYB4a的共表达关系。结果表明,从cDNA文库中初步筛选出39个与NtMYB4a互作的蛋白,经回交验证排除假阳性,最终得到6个与NtMYB4a具有互作关系的蛋白,分别是RALF-like 22蛋白、锌指A20/AN1结构域蛋白、液泡分选蛋白、天冬氨酸蛋白酶、B2蛋白和应激增强蛋白。在低温胁迫下,6种互作蛋白的基因表达量变化趋势与NtMYB4a相似,均呈升高—降低—升高的趋势。相关性分析发现,液泡分选蛋白、B2蛋白、RALF-like 22蛋白和应激增强蛋白基因的表达与NtMYB4a的表达呈正相关关系,锌指A20/AN1结构域蛋白和天冬氨酸蛋白酶基因的表达与NtMYB4a的表达呈较弱的负相关关系,推测NtMYB4a可能与这些蛋白互作参与烟草低温胁迫的防御调控。本研究结果为进一步探究NtMYB4a参与响应非生物胁迫的分子调控机制提供了依据。

烟草转录因子NtMYB4a响应干旱、低温和茉莉酸甲酯胁迫的功能分析

MYB转录因子是植物体内最大的一类转录因子,在植物应对非生物胁迫中发挥重要作用。为探讨烟草NtMYB4a基因在响应干旱、低温和茉莉酸甲酯胁迫下的功能,以NtMYB4a基因的过表达和敲除突变体及野生型烟株为材料,采用RT-qPCR技术分析了干旱、低温和茉莉酸甲酯处理0、1、3、6、12、24和48 h后烟草叶片中NtMYB4a的表达变化以及脯氨酸和丙二醛含量差异。结果显示:过表达突变体中NtMYB4a的表达量极显著高于野生型烟株,且不易受干旱、低温和茉莉酸甲酯胁迫的影响,烟叶中的脯氨酸含量增高,丙二醛含量降低;而基因敲除突变体中NtMYB4a的表达量显著低于野生型烟株,且易受干旱、低温和茉莉酸甲酯胁迫的影响,烟叶中的脯氨酸含量降低,丙二醛含量增加。此外,利用Plant CARE软件分析了NtMYB4a启动子区域,结果显示该区域含有赤霉素、生长素、脱落酸、茉莉酸甲酯、光、干旱、低温等激素和非生物胁迫相关的顺式作用元件。这些结果表明,NtMYB4a基因的表达受干旱、低温胁迫和茉莉酸甲酯的诱导,可能与烟株的抗逆性相关。

NtMYB4a基因对烟草多酚类物质合成的影响

为了解NtMYB4a基因的表达是否与烟草多酚化合物的合成有关,本研究以NtMYB4a过表达和CRISPR/Cas9敲除植株及其野生型植株为试验材料,采用实时荧光定量PCR技术分析NtMYB4a和多酚物质合成相关酶基因PAL、C4H、4CL、HCT的表达,使用HPLC方法测定烟叶中绿原酸、芦丁等8种多酚物质的含量,并进行相关性分析。结果表明,过表达NtMYB4a植株中,除花中的C4H外,茎、叶、花中PAL、C4H、4CL和HCT的表达量均极显著高于野生型,烟株茎、叶、花中绿原酸含量也显著增加;敲除NtMYB4a使烟株花、茎和叶中PAL、C4H、4CL和HCT的表达均下调,其中茎中PAL、HCT的表达极显著下调,使叶和花中的绿原酸、芦丁、槲皮素、莨菪亭含量均显著降低,茎中芦丁含量则显著增加,而山奈酚、芥子酸、对香豆酸和咖啡酸含量无显著性变化;NtMYB4a的表达量与绿原酸含量呈极显著正相关关系,与芦丁、莨菪亭、山奈酚、芥子酸、槲皮素、对香豆酸、咖啡酸含量无显著相关性。因此,NtMYB4基因对烟草绿原酸合成相关酶基因表达及绿原酸合成具有调控作用。本研究结果为进一步阐明烟叶中绿原酸形成的分子机制提供理论依据。

烟草NtMYB4a基因的过表达载体构建、遗传转化与表达分析

MYB转录因子在植物的生长发育、生理代谢、细胞的形态和模式建成等生理过程中发挥重要作用。为了研究一个在优质烟草杂交种及其亲本中差异表达的R2R3-MYB转录因子NtMYB4a的功能。本研究采用PCR技术从烟草中分离出MYB4a的cDNA全长,构建NtMYB4a基因的过表达载体pART-CAM-NtMYB4a。通过根癌农杆菌介导法转化烟草自育品系GDH88获得转化植株,经卡那霉素抗性筛选得到162株抗性苗,PCR检测发现有67株阳性苗,转化率为41.4%。qRT-PCR检测表明NtMYB4a基因在转基因植株的花、茎和叶中的表达量显著提高。为后续研究NtMYB4a的功能提供了试验材料与研究基础。