微RNA-142-5p与E2F7基因的关系及其影响胰腺癌增殖、侵袭、转移的机制研究

目的探讨微RNA-142-5p(miRNA-142-5p)与E2F7基因的关系及其影响胰腺癌(PC)增殖、侵袭、转移的机制。方法选择2016年12月至2019年1月于新疆维吾尔自治区人民医院接受手术治疗的35例PC患者的癌及癌旁组织,采用实时定量PCR检测并比较PC患者癌及癌旁组织中miR-142-5p的表达情况,比较人PC细胞系(CFPAC-1、SW1990、Capan-1、PANC-1)和正常胰管上皮细胞系(HPDE)中miR-142-5p的表达情况。采用实时定量PCR检测并比较PC患者癌及癌旁组织中E2F7 mRNA的差异,比较Capan-1、PANC-1细胞E2F7 mRNA的差异,采用蛋白质印迹法比较Capan-1、PANC-1细胞中E2F7蛋白的差异。通过Starbase数据库预测miR-142-5p与E2F7基因的结合位点,同时设置转染miR-142-5p模拟物的miR-142-5p mimics组和转染无意义序列的NC组,两组分别共转染E2F7基因野生型(wt)及突变体(mut),采用双萤光素酶实验验证miR-142-5p与E2F7基因的靶向关系。将Capan-1细胞设为NC组、si-E2F7组、E2F7组及miR-142-5p mimics+E2F7组,采用CCK-8、流式细胞仪、划痕实验、Transwell实验观察各组细胞活力、凋亡、迁移、侵袭情况。选取20只雄性BALB/c裸鼠(4~6周龄)用于建立裸鼠异种移植模型,采用随机数字表法将其分为NC裸鼠组、si-E2F7裸鼠组、E2F7裸鼠组及miR-142-5p mimics+E2F7裸鼠组,每组5只。将5×10^(6)个相应处理的PC细胞与100μl的人工基膜混合后皮下注射于裸鼠前腿下方的皮肤,于注射后第30天处死四组动物,比较四组肿瘤体积及重量,采用苏木精-伊红染色观察肿瘤转移能力。结果PC患者癌组织miR-142-5p表达低于癌旁组织,E2F7 mRNA表达高于癌旁组织,CFPAC-1、SW1990、Capan-1、PANC-1细胞miR-142-5p表达低于HPDE细胞(P<0.05)。Capan-1、PANC-1细胞E2F7 mRNA及其蛋白表达高于HPDE细胞(P<0.05)。Starbase数据库分析结果显示,miR-142-5p与E2F7基因的3’非翻译区存在互补。双萤光素酶报告基因结果显示,共转染E2F7-wt后,miR-142-5p mimics组萤光素酶活性低于NC组(P<0.05);共转染E2F7-mut后,miR-142-5p mimics组萤光素酶活性与NC组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。E2F7组E2F7 mRNA及其蛋白表达、细胞活力、划痕愈合面积、相对侵袭细胞数均高于NC组,细胞凋亡率低于NC组(P<0.05)。miR-142-5p mimics+E2F7组E2F7mRNA及其蛋白表达、细胞活力、划痕愈合面积、相对侵袭细胞数均低于E2F7组,细胞凋亡率高于E2F7组(P<0.05)。E2F7裸鼠组肿瘤体积、重量高于NC裸鼠组,miR-142-5p mimics+E2F7裸鼠组肿瘤体积、重量低于E2F7裸鼠组(P<0.05)。苏木精-伊红染色显示,E2F7裸鼠组肿瘤具有较强的转移能力,而miR-142-5p mimics+E2F7裸鼠组肿瘤的转移能力较差。结论miR-142-5p可能通过靶向E2F7基因影响PC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡。

烟草ERF基因NtRAP2-7的表达载体构建及表达模式分析

为了研究烟草Nt RAP2-7基因在非生物胁迫响应中的功能,采用同源克隆的方法,在烟草品种K326中克隆到1个ERF转录因子基因Nt RAP2-7。并利用生物信息学软件分析了该基因编码蛋白的理化性质、空间结构与系统进化关系。序列分析结果表明,该基因序列全长1 398 bp,共编码465个氨基酸残基,预测蛋白的分子量为51. 16 ku。该蛋白包含一个由3个β-折叠及1个α-螺旋组成的保守结构,并含有58个磷酸化位点。亚细胞定位预测表明,该蛋白主要定位于细胞核,并包含单分型的核定位信号序列。进化分析表明,Nt RAP2-7蛋白与林烟草RAP2-7蛋白序列同源性最高,为98%。运用q RT-PCR技术进行了该基因的表达模式分析,组织表达分析发现,Nt RAP2-7基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,但在根中的表达量最高。该基因的表达在低钾、高盐、干旱、ABA、H2O2处理下受到诱导和在低温处理下受到抑制,结果表明,烟草Nt RAP2-7基因参与了烟草的非生物胁迫应答反应。并利用双酶切法成功构建了p BI121-Nt RAP2-7过表达载体,为今后该基因在非生物胁迫下的功能研究奠定了基础。

南方水稻黑条矮缩病毒P7-2基因的克隆与原核表达

【目的】为克隆获得南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的P7-2基因并实现其原核表达。【方法】利用RT-PCR技术从感染SRBSDV的水稻叶片中扩增出P7-2基因。利用Gateway重组技术将基因P7-2整合到原核表达载体pDEST17上,获得重组原核表达载体pDEST17-P7-2。随后将原核表达载体pDEST17-P7-2转化到原核表达菌株Rosetta中。利用IPTG诱导P7-2蛋白表达并优化其诱导条件。【结果】利用RT-PCR技术扩增得到基因P7-2,其大小为930 bp。测序结果表明获得原核表达载体pDEST17-P7-2。菌液PCR鉴定了原核表达阳性菌株。在温度为28℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L诱导表达8 h,可获得大量大小约为42 kDa含HIS标签的融合蛋白。【结论】克隆获得了SRBSDVP7-2的基因序列,实现了该基因的原核表达并探索其最佳诱导条件,为南方水稻黑条矮缩病的田间诊断、预测预报及P7-2的功能研究奠定了基础。

基因多态性膜性肾病给予改良Ponticelli方案治疗对PLA2R、8-OHdG、THSD7A的影响

目的:研究基因多态性膜性肾病给予改良Ponticelli方案治疗对磷脂酶A2受体(PLA2R)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、1型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)的影响。方法:从2020年8月至2022年10月在黄梅县中医医院治疗的膜性肾病患者中筛选出研究对象102例,根据其CYP2B6基因型分组,将51例CYP2B6*4基因型患者作为甲组,将51例CYP2B6*5基因型患者作为乙组。两组均给予改良Ponticelli方案治疗。对两组治疗前后血清PLA2R、8-OHdG、THSD7A及24小时尿蛋白定量(24hUPQ)、血清免疫球蛋白G(IgG)、血清白蛋白(ALB)进行横向和纵向对比,并对治疗结果进行横向对比。结果:治疗前两组的血清PLA2R、8-OHdG、THSD7A及24hUPQ、血清IgG横向对比无明显差异,P>0.05。治疗后两组的血清PLA2R、8-OHdG、THSD7A及24hUPQ、血清IgG横向对比,乙组均更低,P<0.05。两组治疗前与治疗后的血清PLA2R、8-OHdG、THSD7A及24hUPQ、血清IgG纵向对比,治疗后均更低,P<0.05。治疗前两组的血清ALB横向对比无明显差异,P>0.05。治疗后两组的血清ALB横向对比,乙组更高,P<0.05。两组治疗前与治疗后的血清ALB纵向对比,治疗后更高,P<0.05。两组的治疗总有效率横向对比,乙组更高,P<0.05。结论:基因多态性膜性肾病给予改良Ponticelli方案治疗可获得良好的疗效,其中相较于CYP2B6*4基因型患者,CYP2B6*5基因型患者在PLA2R、8-OHdG、THSD7A、24hUPQ、IgG、ALB的改善方面效果更优。

血清Nox2、ATG7水平对新生儿窒息心肌损伤的评估价值

目的探讨自噬相关基因-7(ATG7)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(Nox2)在新生儿窒息病儿血清中的表达及早期诊断价值。方法选取2019年1月至2021年12月在郑州大学第三附属医院产科分娩的75例新生儿窒息病儿为研究组,根据是否合并心肌损伤将病儿分为窒息心肌损伤组31例,窒息非心肌损伤组44例。同期选择50例健康足月新生儿为对照组。收集一般资料,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量血清ATG7水平,采用蛋白质印迹法检测Nox2水平,以Nox2/β肌动蛋白的灰度比值为Nox2表达量;采用Pearson法分析ATG7、Nox2表达的相关性及与各指标的相关性;利用受试者操作特征曲线(ROC曲线)评价Nox2、ATG7水平对新生儿窒息心肌损伤的诊断价值。结果与对照组[0.26±0.06、(4.83±0.61)ng/L]比较,新生儿窒息病儿血清Nox2(0.65±0.09)、ATG7[(21.04±3.66)ng/L]表达水平升高,且窒息心肌损伤组[0.85±0.11、(24.23±3.98)ng/L]病儿血清中Nox2、ATG7水平高于窒息非心肌损伤组[0.51±0.08、(18.80±3.43)ng/L](P<0.05);窒息心肌损伤病儿血清中Nox2、ATG7表达呈显著正相关(r=0.57,P<0.05);病儿血清中Nox2和ATG7表达与肌酸激酶同工酶(CK-MB)、缺血修饰白蛋白(IMA)、超敏C-反应蛋白(hs-CRP)、氨基末端脑钠肽前体(NT-ProBNP)、肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白表达均呈正相关(P<0.05);ROC曲线结果显示,血清Nox2、ATG7水平预测新生儿窒息合并心肌损伤的曲线下面积(AUC)及其95%CI分别为0.91(0.82,0.96)、0.89(0.80,0.95),对应的灵敏度分别为83.87%、87.10%,特异度分别为84.09%、75.00%,二者联合预测的AUC及其95%CI为0.92(0.84,0.97),灵敏度为90.32%,特异度为81.82%。结论窒息心肌损伤病儿血清中Nox2、ATG7表达均上调,二者联合检测对窒息心肌损伤有一定的诊断价值。

线粒体融合素基因-2对人乳腺癌MCF-7细胞株增殖与化疗敏感性的影响

背景与目的:线粒体融合素基因-2(mitofusin-2gene,mfn2)是作用于线粒体外膜的一种增殖抑制基因,mfn2过表达可抑制血管平滑肌细胞的增殖。本研究探讨外源性mfn2对人乳腺癌细胞MCF-7增殖以及化疗敏感性的影响。方法:将含有mfn2cDNA的质粒在阳离子聚合物的介导下体外转染MCF-7细胞,Westernblot法检测绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的表达,细胞计数及MTT法检测mfn2对MCF-7细胞增殖的影响,流式细胞术检测MCF-7细胞周期分布及喜树碱处理前后细胞凋亡的变化。结果:转染mfn2基因的MCF-7细胞可以稳定高表达GFP。MTT实验提示转染mfn2cDNA后,MCF-7细胞增殖明显受到抑制,DNA直方图显示细胞停滞于S期,转染mfn2cDNA组S期细胞比率为(42.7±1.3)%,高于转染空质粒组的(17.2±2.0)%和空白对照组的(19.6±1.7)%(P<0.05)。mfn2基因转染后诱导的细胞凋亡率从(3.6±0.6)%升高到(16.0±0.3)%;加入喜树碱4h后转染mfn2基因的细胞凋亡率为(69.6±4.3)%,高于转染空质粒组的(31.0±1.8)%和空白对照组的(23.4±2.8)%(P<0.05)。结论:转染mfn2基因可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,增强MCF-7细胞对喜树碱的敏感性。

B7-1与B7-2对调节人IL-2基因的转录因子NF-κB和AP-1的相同作用

为了解B7共刺激对细胞因子 ,特别是对IL 2mRNA及转录因子NF κB和AP 1的影响 ,探讨B7介导的IL 2调节的分子机制 ,在异基因混合淋巴细胞反应 (MLR)体系中分别或联合加入抗B7 1、抗B7 2单克隆抗体和CTLA 4Ig以阻断B7/CD2 8信号传导 ,通过竞争性PCR定量检测其对IL 2和IL 4mRNA的影响 ,并初步测定IFN γmRNA的改变 ,同时用转染MHCⅡ类分子及联合转染等量B7 1或B7 2的NIH3T3转基因细胞tDR7,tDR7/B7 1和tDR7/B7 2刺激CD2 8+ T细胞 ,通过DNA 蛋白结合实验观察B7对IL 2转录因子NF κB和AP 1的影响。结果表明 :抗B7 2单抗和CTLA 4Ig可明显抑制B7介导的IL 2和IL 4mRNA合成 ,而抗B7 1单抗仅有轻度抑制作用 ,2种或 3种抗体联合应用时抑制作用相加。MLR 1 - 6小时 ,单独tDR7即可诱导NF κB的表达 ,联合转染B7早期对其结合活力无明显影响 ,6小时后tDR7诱导作用减弱 ,B7却可显著延长tDR7的诱导作用至 72小时。tDR7早期同样可诱导AP 1的表达 ,联合转染B7分子在 2 4小时内对其有一定的抑制作用 ,而在反应后期可延长tDR7对AP 1的上调作用 ,B7 1与B7 2间作用未见明显不同。结论 :B7通过减少IL 2mRNA降解和影响基因转录而上调IL 2分泌 ,并可同时影响多种细胞因子分泌 ;在转录水平B7 1与B7 2作用未见明显不同 。

人B7-2和增强型绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建

目的 构建含人B7- 2与增强型绿色荧光蛋白融合基因表达载体p EGFP- N3- B7- 2。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)方法从重症肌无力患者胸腺组织中扩增到人B7- 2 c DNA基因片段,经回收、纯化、酶切后,依次连接到质粒p GEM- Teasy和p EGFP- N3上。结果 通过酶切和序列分析证实插入片段序列正确。结论 应用基因工程技术构建成功p EGFP- N3- B7- 2融合基因表达载体,为增强型绿色荧光蛋白作为人B7- 2生物标记分子,转染肿瘤细胞及树突状细胞制备疫苗奠定了基础。

Mfn2基因过表达对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及EGFR、EGF蛋白表达的影响

目的通过使人乳腺癌MCF-7细胞过表达线粒体融合素基因-2(Mfn2),研究外源性Mfn2基因对MCF-7细胞增殖及对表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)蛋白表达的影响。方法实验分为对照组、转染空质粒pEGFP-N1组、转染Mfn2质粒的pEGFP-Mfn2组。转染48h后,检测各组细胞的转染效率、Mfn2mRNA及Mfn2蛋白表达。检测各组MCF-7细胞增殖情况、各组MCF-7细胞周期分布情况。同时检测各组EGFR及EGF蛋白表达情况。结果转染48h后pEGFP-N1组及pEGFP-Mfn2组转染效率分别为(49.15±2.04)%及(51.10±2.18)%,高于对照组[(0.58±0.21)%,P<0.05];pEGFP-Mfn2组的Mfn2mRNA及Mfn2蛋白表达均显著高于对照组及pEGFP-N1组(P<0.05);pEGFP-Mfn2组MCF-7细胞增殖抑制率显著高于其余两组(P<0.05),细胞周期主要阻滞于G0/G1期;pEGFP-Mfn2组EGFR和EGF蛋白表达水平显著低于其余两组(P<0.05)。结论 Mfn2基因过表达可显著抑制MCF-7细胞增殖,其机制可能与Mfn2基因过表达导致了EGFR及EGF表达下调有关。

锌转运蛋白-8及转录因子7类似物-2基因多态性与中国南方汉族人2型糖尿病的相关性

目的研究锌转运蛋白-8基因(SLC30A8)多态性位点rs13266634及转录因子7类似物-2基因(TCF7L2)多态性位点rs11196218与2型糖尿病(T2DM)以及相关代谢指标的关系。方法T2DM患者(T2DM组)259例,健康者(NC组)200名,均来自上海及周边地区。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术判断标本基因型,同时进行人体测量学及代谢指标的检测,并分别采用稳态模型评估胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及胰岛B细胞分泌功能指数(HOMA-B)评估胰岛素抵抗和胰岛B细胞功能。结果①T2DM组中,rs13266634的C等位基因频率和CC基因型频率分别为57.3%和33.6%,均显著高于NC组的45.4%和17.2%(P值均<0.05)。②C等位基因携带者患T2DM的风险是T等位基因携带者的1.59倍(OR=1.59,95%CI为1.19～2.11,x^2=9.831,P=0.002)。与TT基因型相比,CC基因型患T2DM的风险增加2.63倍(OR=2.63,95%CI为1.42～4.87,x^2=9.69,P=0.002)。③T2DM组与NC组的TCF7L2(rs11196218)基因型及等位基因频率的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。④T2DM组中,CC基因型的HOMA-B显著低于TT基因型(P=0.002)。结论SLC30A8基因rs13266634多态性位点的C等位基因可能是中国人T2DM的风险等位基因,而TCF7L2基因rs11196218单核苷酸多态性可能与T2DM的遗传易感性无关。

人乳头瘤病毒E7与人干扰素α-2b融合基因在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的:构建人乳头瘤病毒(HPV)11-E7及人干扰素(IFN)α-2b的真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。方法:同时用KpnⅠ、EcoRⅠ酶切pET-32a-IFNα-2b-linker-HPV11-E7及pcDNA3.1,将酶切产物纯化回收,两者的回收产物进行连接反应。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,随机挑选阳性克隆并提取质粒酶切鉴定;用脂质体法转染CHO细胞,用免疫荧光法检测融合基因的表达。结果:DNA测序结果显示,成功地将IFN-α-2b-linker-HPV11-E7装入pcDNA3.1的KpnⅠ、EcoRⅠ酶切位点之间,且其序列与设计完全一致;激光扫描共聚焦显微镜观察可见目的蛋白的表达。结论:成功地构建了HPV11-E7及IFNα-2b的真核表达载体,并在CHO细胞中表达,为提高DNA疫苗免疫效果的研究奠定了基础。

B7-2基因联合自杀基因治疗乳腺癌移植瘤模型

目的观察树突状细胞活化抗原B7-2基因联合自杀基因系统EC-CD/5-FC于实验性乳腺癌的体、内外治疗的协同作用。方法用重组腺病毒构建CD和B2-7载体,体外感染人乳腺癌MCF-7细胞,荧光显微镜观察其感染率。然后给与前药5-FC,通过MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况;Annexi V-FTTC/PI双染流式细胞术检测MCF-7细胞的细胞周期。BALB/C小鼠腋窝下注射MCF-7细胞制备乳腺癌移植瘤模型,待肿瘤直径达0.5 cm大小,分别在肿瘤局部直接注射Ad CD/B7-2,然后连续10 d腹腔注射5-氟胞嘧啶(5-FC),免疫组化法检测肿瘤组织中CD8+T表达。结果 MTT法检测显示MCF-7细胞对前药有较高的敏感性,Ad CD/5-FC/Ad B7-2和Ad CD/5-FC组MCF-7细胞的增殖均受到明显抑制(P<0.05);而Ad B7-2治疗基因对MCF-7细胞的增殖没有任何影响。在感染复数为100时流式细胞仪检测,Ad CD/5-FC/Ad-B7-2组和Ad CD/5-FC组均出现典型的凋亡峰,细胞周期分析显示治疗后G0~G1期比率增多,G2~M及S期细胞减少。在MCF-7移植瘤模型中,Ad CD/5-FC/Ad-B7-2治疗后移植瘤的生长明显受到抑制;肿瘤瘤体内或瘤体周围CD8+T细胞浸润增加。结论 B7-2联合自杀基因系统对乳腺癌MCF-7细胞及其MCF-7细胞移植瘤均有明显的抑制作用,B7-2联合自杀基因Ad CD/5-FC系统时,共刺激分子B7-2可通过增强和诱导的特异抗肿瘤免疫,有效减少肿瘤负荷,增强Ad-CD/5-FC系统对肿瘤的杀伤作用。

鸡球虫微线基因mic2-7h在大肠杆菌中的表达

本文在大肠杆菌中表达了鸡球虫孢子化7h微线基因mic2-7h.质粒pmic2-7h经AatⅡ酶切线化,用Sl核酸酶切平DNA分子,再用NotⅠ切出mic2-7h片段,插入表达质粒pET28-a(+)的6xHis下游NheⅠ处构建成表达载体pET28-mic2-7h.IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE分析表明表达的重组蛋白大小为45kD,约比理论推算值(37kD)小,但Western-blotting杂交表明重组蛋白能与兔抗Etmic-2抗体反应.这进一步说明了Mic2-7h可能是Etmic-2的一种蛋白异形体.

直肠癌组织中YTHDF2、lncRNA TUSC7表达与上皮间质转化的关系及预后意义

目的研究直肠癌组织中YTH结构域N6-甲基腺嘌呤RNA结合蛋白2(YTHDF2)、长链非编码RNA抑癌候选基因7(lncRNA TUSC7)表达与上皮间质转化(EMT)的关系及临床预后意义。方法选取该院自2018年5月至2020年5月诊治的98例直肠癌患者。采用实时荧光定量PCR检测直肠癌组织和癌旁组织中YTHDF2、lncRNA TUSC7表达及EMT相关指标β-连环素(β-catenin)、E-钙黏蛋白(E-cad)、N-钙黏蛋白(N-cad)mRNA的表达。采用Pearson法分析YTHDF2 mRNA、lncRNA TUSC7与EMT相关指标的相关性。采用Kaplan-Meier曲线分析YTHDF2、lncRNA TUSC7表达对直肠癌无瘤生存预后的影响。采用多因素COX回归分析直肠癌无瘤生存预后的影响因素。结果直肠癌组织中YTHDF2、β-catenin、N-cad mRNA相对表达水平高于癌旁组织,而lncRNA TUSC7、E-cad mRNA相对表达水平低于癌旁组织(均P<0.05)。直肠癌组织中YTHDF2 mRNA与β-catenin、N-cad mRNA表达呈正相关(均P<0.05),与E-cad mRNA表达呈负相关(均P<0.05);lncRNA TUSC7与β-catenin、N-cad mRNA表达呈负相关(均P<0.05),与E-cad mRNA表达呈正相关(均P<0.05)。直肠癌组织中YTHDF2 mRNA与lncRNA TUSC7表达呈负相关(P<0.05)。直肠癌组织中YTHDF2 mRNA、lncRNA TUSC7与TNM分期Ⅲ期、肿瘤分化程度及淋巴结转移有关(均P<0.05)。YTHDF2高、低表达组3年无瘤生存率分别为59.57%(28/47)、88.24%(45/51)。lncRNA TUSC7高、低表达组3年无瘤生存率分别为88.00%(44/50)、60.42%(29/48)。YTHDF2高表达组3年累积无瘤生存率低于YTHDF2低表达组(Log Rankχ^(2)=11.370,P=0.001)。lncRNA TUSC7高表达组3年累积无瘤生存率高于lncRNA TUSC7低表达组(Log Rankχ^(2)=11.880,P=0.001)。TNM分期Ⅲ期、低分化程度、合并淋巴结转移、YTHDF2高表达、lncRNA TUSC7低表达是直肠癌患者无瘤生存预后的独立危险因素(均P<0.05)。结论直肠癌组织中YTHDF2表达上调,lncRNA TUSC7表达下调,二者与不良临床病理特征及EMT有关,是新的评估直肠癌患者预后的标志物。

重组B7-1/B7-2逆转录病毒载体的构建及其在小鼠肝癌基因治疗中的应用

目的构建表达Ｂ７－１／Ｂ７－２的重组逆转录病毒载体，并观察Ｂ７－１／Ｂ７－２的表达对体内外抗小鼠肝癌免疫反应的影响。方法粘端定向克隆构建重组逆转录病毒载体ＬＸＳＮ－ｍＢ７－１和ＬＸＳＮ－ｍＢ７－２，依次转导包装细胞系ＰＥ５０１和ＰＡ３１７，并用重组病毒上清感染小鼠肝癌细胞系Ｈｅｐａｌ－６，流式细胞术检测Ｂ７－１／Ｂ７－２的表达，并用Ｂ７－１／Ｂ７－２表达阳性的Ｈｅｐａｌ－６在体内外诱导抗肿瘤免疫反应。结果１．表达Ｂ７－１／Ｂ７－２阳性的Ｈｅｐａｌ－６致瘤性明显降低；２．单独Ｂ７－１／Ｂ７－２基因转染仅能诱导部分细胞毒性和部分保护性免疫反应；３．Ｂ７－１／Ｂ７－２基因转染与细胞因子处理联合应用则能诱导强烈的细胞毒性和完全的抗Ｈｅｐａｌ－６保护性免疫反应。结论Ｂ７－１／Ｂ７－２共刺激分子在小鼠肝癌的表达是激活抗肿瘤免疫所必需的但不是充分的条件。

双表达B7-1、B7-2基因肿瘤疫苗治疗小鼠肝癌优于单表达疫苗的研究

目的:研究B7-1、B7-2基因对肿瘤的免疫治疗作用。方法:应用转染有B7-1、B7-2基因的肝癌细胞株H22/B7-1、H22/B7-2,建立小鼠肝癌模型,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小。结果:各实验组动物都发生肿瘤,接种H22/B7-1+H22/B7-2组成瘤率低,对照组动物肿瘤呈进行性生长;组间成瘤潜伏期不同,与对照组相比,凡接种有H22/B7-2的小鼠肿瘤形成有迟发性;接种转B7基因细胞的小鼠肿瘤生长都较对照组慢;同时接种H22/B7-1和H22/B7-的小鼠能负载大于107的肿瘤细胞。转基因细胞在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显增强。结论:B7-1、B7-2都能增强肝癌细胞的免疫原性。B7-2在抗肿瘤早期发挥作用,B7-1随后起放大和调节作用。B7-1与B7-2联用效果优于单一应用。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷逆转RASSF1A基因甲基化对人乳腺癌MCF-7细胞的影响

目的:探讨启动子甲基化对乳腺癌MCF-7细胞RASSF1A基因的作用及5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)干预对启动子甲基化的影响,为临床治疗乳腺癌奠定理论基础.方法:用1,3,5,7,9μmol/L不同浓度的5-Aza-CdR处理MCF-7乳腺癌细胞株,通过MTT检测5-Aza-CdR对MCF-7乳腺癌细胞株存活率的影响;建立5μmol/L,10μmol/L的浓度梯度流式细胞仪检测5-Aza-CdR对MCF-7乳腺癌细胞株生长周期及凋亡率的影响,MSP(甲基化PCR)检测5-Aza-CdR处理前后RASFF1A抑癌基因的甲基化状态,RT-PCR检测处理前后抑癌基因RASSF1A mRNA表达情况.结果:5-Aza-CdR抑制体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞,诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡和细胞周期停滞在G0/G1期,呈浓度依赖性.经5-Aza-CdR处理人乳腺癌MCF-7细胞后,MSP检测RASSF1A基因发生了甲基化,RT-PCR检测RASSF1A mRNA恢复了表达.结论:RASSF1A基因启动子甲基化是导致其失活的主要原因,5-Aza-CdR可以逆转乳腺癌细胞株MCF-7细胞RASSF1A基因启动子甲基化状态,使其重新表达.

干扰素α-2b对宫颈癌细胞HPV16 E6E7基因抑制作用的研究

目的 研究干扰素α- 2b对宫颈癌SiHa细胞生长的调节作用,从细胞生物学及分子生物学水平探讨干扰素α- 2b对宫颈癌细胞SiHa的作用机制。应用RT -PCR半定量检测细胞内HPV16E6E7mRNA表达,观察干扰素α- 2b对宫颈癌SiHa细胞中HPV16E6E7mRNA表达的影响。方法 以不同浓度的人重组干扰素α- 2b含药培养液作用于感染HPV16的人宫颈癌细胞系—SiHa细胞,并设立无药对照,通过MTT及流式细胞分析技术检测该药对细胞生长及增殖的影响;进行细胞凋亡检测并用RT -PCR法半定量检测对HPV16E6E7基因表达的影响。结果 经含有干扰素α- 2b的培养液作用后,细胞数量减少,10 0 0IU/ml的干扰素α- 2b对细胞抑制作用最强;细胞周期各时相中,S期细胞所占比例明显减少;均可诱导细胞凋亡;均使细胞中HPV16E6E7mRNA表达明显减少。结论 干扰素α- 2b不仅可直接抑制宫颈癌细胞的生长,并可能通过抑制HPV16E6E7基因表达的分子机制,达到抑制肿瘤目的。

腺病毒介导的IL-2基因及B7-1基因联合转染G422细胞致瘤原性和免疫原性的变化

目的:研究联合细胞因子基因转染的G422胶质母细胞瘤细胞体内致瘤原性和免疫原性的变化,为胶质瘤的免疫基因治疗打下基础。方法:IL-2基因和B7-1基因转染的G422细胞1×105皮下和脑内接种,观察肿瘤生长速度和荷瘤小鼠的存活期,2周取脾脏,检测NK、LAK和CTL的杀伤活性。结果:IL-2和B7-1基因联合转染的G422细胞,皮下接种后肿瘤生长明显减慢,脑内接种动物存活期明显延长,NK、LAK和CTL的杀伤活性增强。结论:IL-2基因和B7-1基因联合转染的G422细胞,致瘤原性下降,免疫原性增强,能有效激活机体特异性与非特异性抗肿瘤免疫反应。

肺癌组织和外周血中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白水平检测及其临床价值探讨

背景与目的:肺癌发病机制具有多样性,但一经确认,往往已错过最佳治疗时机,本文通过探讨肺癌组织和外周血中抑癌基因(p53)、蛋白基因产物(PGP9.5)、转录因子(SOX2)、肿瘤相关基因编码蛋白(GAGE7)、解旋酶(GBU4-5)和黑色素瘤抗原(MAGE A1)蛋白水平的相关性,同时分析其在肺癌诊疗中的应用价值。方法:回顾并分析2018年5月—2020年5月在复旦大学附属肿瘤医院确诊的100例肺癌患者的病历资料,临床TNM分期Ⅰ期25例,Ⅱ期45例,Ⅲa期30例;非小细胞肺癌80例,小细胞肺癌20例;取手术切除的肿瘤组织和癌旁组织,采用免疫组织化学染色法检测上述6种蛋白的水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)法检测其基因表达,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测外周血中6种蛋白的抗体阳性情况。结果:肿瘤组织中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的阳性率和基因表达水平均明显高于癌旁组织(P<0.05);将其与肿瘤的临床病理学特征进行相关分析发现,肿瘤组织和外周血中的p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的阳性率和基因表达水平与肿瘤TNM分期和分化级别有关(P<0.05),而与患者性别、年龄、肿瘤直径、病理学类型无关(P>0.05)。肿瘤组织中6种蛋白的表达水平与外周血清表达具有较好的一致性(P>0.05)。结论:肺癌肿瘤组织和外周血中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白表达阳性与肿瘤TNM分期及分化级别密切相关。