烟草新驱动蛋白NtTKR过表达对酵母生长的影响

为了解烟草新驱动蛋白NtTKR功能信息,构建了EGFP融合的NtTKR基因酵母表达载体并转入酿酒酵母W303诱导表达,荧光显微镜观察结果表明,诱导条件下的转化细胞发出明亮的绿色荧光,表明转入的NtTKR得到了高效表达.转化株在诱导和非诱导条件下培养3d,可见NtTKR过表达菌落比对照小的多;但通过绘制8h内生长曲线发现二者细胞数目无显著差别;表明NtTKR过表达对酵母细胞生长的抑制可能更多的是因为抑制其体积增大,而非分裂速度减慢引起的细胞数目降低.已知NtTKR在烟草受精卵、发育各个时期的胚、幼叶、根尖及茎尖等细胞分裂旺盛部位均优势表达,推测该基因在烟草中可能与上述各部位新生细胞的体积增大相关.

烟草新驱动蛋白基因NtTKR原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化

通过对烟草驱动蛋白家族新成员Nt Tkr尾部的酵母双杂交筛选,得到多个与Nt Tkr互作的候选蛋白。为进一步验证NtTkr与候选蛋白之间的相互作用,以p GBKT7-Nt Tkr质粒为模板,PCR扩增烟草NtTKR全长,将其克隆入原核表达载体pMXB10,重组质粒pMXB10-NtTkr-3582经生物公司测序,结果正确。将其转化为BL21(DE3),IPTG诱导其表达目的蛋白,经几丁质法纯化及SDS-PAGE检测,结果表明笔者得到了高纯度的目的蛋白。该试验为进一步运用Pull Down确定Nt Tkr与候选蛋白之间的体外互作及深入研究该蛋白的其他生物学功能奠定了基础。

烟草NtTkr尾部T1084缺失和替换突变原核表达载体的构建及诱导表达

已知烟草驱动家族新成员NtTkr尾部第3个卷曲螺旋(Coiled-coil,CC3)第1084位苏氨酸(T1084)对靶蛋白的结合至关重要,通过对NtTkr尾部的酵母双杂交筛选得到多个与Ntkr互作的候选蛋白。为确定T1084缺失(T1084d)或替换(T1084A)突变对NtTkr与这些候选蛋白体外互作的重要性,首先以pBI121-NtTkr为模板,通过重叠延伸PCR扩增得到烟草NtTkr尾部T1084d、T1084A片段并将其克隆入质粒pUC19,经蓝白斑筛选、SmaⅠ-BamHⅠ双酶切鉴定后送去测序,获得正确的T1084缺失和替换的NtTkr尾部;然后将重组的pUC19-T1084d、pUC19-T1084A与pMXB10进行NotⅠ-NdeⅠ双酶切,回收目的片段和载体片段并连接,连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α,筛选得到重组子,进行NotⅠ-NdeⅠ双酶切鉴定,最终成功构建pMXB10-NtTkr-T1084A和pMXB10-NtTkr-T1084d原核表达载体;最后将原核表达载体pMXB10-T1084d和pMXB10-T1084A转入BL21(DE3)中,分别经0.05,0.06mmol/LIPTG浓度诱导,12%SDS-PAGE电泳检测蛋白质表达情况,结果证明获得了NtTkr-T1084d-1317和NtTkr-T1084A-1320的成功表达,且IPTG浓度大于0.06mmol/L时,均可高效表达约77ku的NtTkr-T1084A-1320和76.2ku的NtTkr-T1084d-1317蛋白量。

烟草NtTkr尾部点突变对卷曲螺旋结构及与靶蛋白相互作用的影响

NtTkr是个在烟草分裂旺盛组织中优势表达的驱动家族新成员,尾部有3个卷曲螺旋(Coiled-coil,CC1-3),已知位于CC3 1084位的T缺失或点突变会影响其分布,推测该改变可能受与其结合的蛋白底物的影响。为确定T1084缺失或点突变对NtTkr与候选蛋白互作的影响,通过重叠延伸PCR在烟草NtTkr尾部引入T1084缺失(T1084d)和T1084A点突变,克隆入pGBKT7获诱饵表达载体,转入AH109并分别与携带pGADT7-H2A/Sulfer/NT3的Y187接合后进行双杂交检测。结果表明T1084A与T相近,但先于T显蓝色,且颜色较T深;T1084d明显不如T;一级结构和Coiled-coil软件分析表明T1084处于CC3的a位,属极性亲水氨基酸,将其替换为非极性疏水的丙氨酸可增强七肽重复序列结构域(HR结构域)的疏水性,并造成七肽重复序列增长,T1084缺失则造成其缩短。表明增加HR结构域的疏水性和七肽重复序列的长度可增强NtKrp与候选蛋白的互作,而缩短卷曲螺旋的长度则造成其相互作用的减弱。