基于核酸杂交反应的荧光生物传感器的制备及在黄曲霉毒素B_1检测中的应用

采用核酸适配体作为特异性识别元件,SYBR Green I(SGI)荧光染料为信号输出单元,构建了黄曲霉毒素B_1(AFB_1)生物传感器,并对试验条件进行了优化。优化的试验条件如下:适配体互补链与适配体的物质的量比为1.5,SGI加入量为10μL,适配体双链与SGI的作用时间为2 min,适配体与AFB_1作用时间为14 min。结果表明,在AFB_1质量浓度为0.1~1 000μg·L^(-1)时,荧光强度变化量与其质量浓度对数呈线性关系,检出限(3S/N)为0.081μg·L^(-1)。对实际玉米样品进行加标回收试验,回收率为95.2%~105%,测定值的相对标准偏差(n=7)均小于6.0%。与其他适配体传感器进行比较,该方法所构建的荧光适配体传感器对AFB_1的检测具有操作简便、检测范围宽、灵敏度高、特异性强、成本低廉等优点,适合现场快速测定。

钴系氧化物载体磁性微球的制备和研究

磁性纳米材料因具有毒性小、催化作用强、分散性快、性质稳定等优异性能,因此在纳米材料科学领域被广泛应用,在新材料,能源,信息,生物医学等各个领域发挥举足轻重的作用。其中,钴系氧化物因其表面原子的占比较高,比表面积较大,故通常具有良好的表面效应,因而具有较高的负载能力。本研究采用液相沉淀法制备了Co3O4纳米颗粒,然后将L-酪氨(L-Tyrosine)通过化学键合的方式修饰到Co3O4纳米颗粒表面,得到了Co3O4@L-Tyrosine磁性纳米复合材料;采用了扫描电子显微镜、凝胶电泳、红外和紫外光谱分析等实验对其进行形貌和性能表征。实验结构表明,表面修饰L-Tyrosine的Co3O4纳米材料在核酸提取和染料降解方面具有显著的效果。

核酸扩增实时检测荧光染料的研究进展

核酸扩增反应能够在短时间内将特定DNA模板的数量增加106~109倍,显著提高微量核酸检测的灵敏度,但同时扩增产物的遗漏极易造成交叉污染,影响后续检测。扩增反应通过添加荧光染料实现的实时闭管检测,不仅可以避免反应结束后开管操作所导致的交叉污染,还可以通过反应动力学对样品中模板的起始拷贝数定量,以及通过熔解曲线分析鉴别多种靶标来源、进行基因突变扫描和基因分型检测。目前常用的商业化实时检测荧光染料,如SYBR Green I、Eva Green等,其精确结构信息尚未披露,因此只能通过实验“试错法”选取合适染料,无法从根本上获知染料结构和分析性能之间的关系。本文将通过对目前常用的核酸实时检测荧光染料性质和应用进行总结,为其优化选择、设计和开发提供参考依据。

影响琼脂糖凝胶电泳条带扭曲程度的因素

在不同的电压与载样量下,分别使用溴化乙锭(EB)与新型核酸染料GoldViewna II及GoldView对凝胶中的DNA进行染色,观察电泳条带扭曲程度,了解电压、载样量与核酸染料对琼脂糖凝胶电泳条带扭曲程度的影响。使用GoldViewna II染色,当电压≥10V/cm时,DNA条带的扭曲程度随载样量增大而加剧;当DNA载样量≥10ng时,DNA条带的扭曲程度随电压升高而加剧。使用EB染色,仅当载样量≥50ng时,条带出现轻微扭曲,扭曲程度与电压无明显关系。结果表明使用GoldView染色,当电压不超过20V/cm或载样量不超过100ng时,DNA条带不扭曲。在琼脂糖凝胶电泳中,若要避免DNA条带扭曲干扰实验结果,使用GoldViewna II染色,若DNA载样量≥10ng,应控制电压≤5V/cm;使用EB染色,载样量应≤50ng;使用GoldView染色,可以使用20V/cm的电压缩短实验时间。

基于分子信标及核酸染料SYBR Green Ⅰ定量检测土壤中的汞

利用分子信标、单链核酸（ss DNA）及核酸染料SYBR GreenⅠ,通过同步荧光分析法,建立了一种高灵敏、高选择性土壤汞（Hg2＋）的定量检测方法。在该体系中,分子信标的荧光基团设计为荧光胺（FAM）,分子信标的环设计为与ss DNA互补,但有4个T碱基错配的序列。在Hg2＋存在时,分子信标的环与ss DNA通过＂T-Hg2＋-T＂特异性结合形成双链DNA,分子信标的茎被打开,荧光基团与猝灭基团分开,荧光恢复;同时,核酸染料SYBR GreenⅠ与双链DNA作用,SYBR GreenⅠ的荧光信号显著增强。SYBR GreenⅠ与FAM的最大激发波长与最大发射波长都很接近,通过同步荧光分析法检测时,两种荧光染料的荧光峰重叠,荧光信号增强,可实现Hg2＋的高灵敏检测。体系的最优检测条件为：缓冲溶液的p H=8.0,孵育温度为50℃,孵育4 min,缓冲溶液中Na Cl的浓度为30 mmol/L,SYBR Green I工作液的体积为100 0L。在优化条件下,Hg2＋浓度在5×10 10~4.0×10 8mol/L时,SYBR GreenⅠ及FAM总的荧光强度（ΔI,为体系在存在和不存在Hg2＋时的荧光强度之差）与Hg2＋浓度（C）间有良好的线性关系,其拟合的回归方程为ΔI=1.3949C＋19.3596（R2=0.9976）,方法检出限（3σ）为3×10 10mol/L。本方法操作简单、快速、选择性好、灵敏度高、重复性好。

核酸-某些碱性三苯甲烷染料体系的RRS及其分析应用

在Tris缓冲溶液中 ,核酸能与某些碱性三苯甲烷染料如乙基紫 (EthylViolet,EV)、结晶紫 (CrystalViolet,CV)和甲基紫 (MethylViolet,MV)结合而使共振瑞利散射 (RRS)急剧增强并产生新的RRS光谱 .以鲱鱼精DNA (HerringSpermDNA ,hsDNA)为例考察了其相应的光谱特征、影响因素和适宜的反应条件 ,体系均在hsDNA浓度为 0～ 2 0μg/mL时与散射强度呈直线关系 ,方法具有较高的灵敏度 ,其检出限 (3σ)分别为 4 7ng/mL(EV hsDNA体系 ) ,13 0ng/mL (CV hsDNA体系 )和 12 2ng/mL (MV hsDNA体系 ) .考察了某些共存物质的影响 ,并用于合成样品中核酸的测定 。

三种染色方式下四种核酸染料的灵敏度比较

目的探讨补镁对高脂高糖膳食诱导大鼠肥胖模型形成的影响及作用机制。使用染胶法、染样品法及后染法比较溴化乙锭(EB)与3种新型核酸染料GoldViewnaII、GoldView及DNA Green染色DNA的灵敏度。方法在琼脂糖凝胶电泳中,分别在3种染色方式下使用4种核酸染料对凝胶中的DNA进行染色,观察并分析电泳结果。结果核酸染料比较结果:GoldViewnaII的灵敏度最高,DNA Green的灵敏度与EB相当,GoldView的灵敏度略低于EB。染色方式比较结果:使用染胶法的灵敏度最高,后染法次之,染样品法最低。结论三种新型核酸染料完全可以替代EB,用于琼脂糖凝胶电泳DNA染色。使用新型核酸染料建议采用染胶法染色DNA。

核酸荧光染料在琼脂糖凝胶电泳中的染色特性

目的建立比溴化乙锭(EB)更为安全的核酸染色方法。方法对SYBR Gold,SYBR GreenⅠ,Gold-View和EB等4种核酸荧光染料在琼脂糖凝胶中的染色特性进行比较分析。结果SYBR Gold和SYBR GreenⅠ可改变核酸的电泳迁移率及相应的DNA大小判断,但二者是比EB更为完全和经济的核酸荧光染料;对于小片段DNA,SYBR Gold的灵敏度高于SYBR GreenⅠ。结论SYBR Gold和SYBR GreenⅠ是比EB更为完全和经济的核酸荧光染料,适合于分子生物学实验室的常规应用。

猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP检测方法的建立

研究针对美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守的N蛋白基因设计了4条LAMP的检测引物,通过优化反应条件,建立了一种检测PRRSV的LAMP诊断方法。特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测美洲型PRRSV,其最低检测限为1×101个拷贝,而常规PCR的最低检出限为1×105个拷贝。判定检测结果时不需要借助昂贵仪器设备,仅需加入1μL橙红色核酸染料就可以进行判断,颜色变绿判定为阳性,仍保持为橙红色判定为阴性。LAMP可以快速、直观、准确地检测PRRSV,是一种适合猪场现地应用的检测方法。

利用无标记的分子信标及核酸染料Hoechst 33258检测特定序列核酸

利用无标记的分子信标及核酸染料Hoechst 33258建立了一种高灵敏、高选择性的特定序列核酸检测方法,并以野生型乙型肝炎病毒的一段寡核苷酸序列为目标DNA,对这种方法进行了验证。在此体系中,分子信标的茎完全设计成C/G碱基对。在没有目标DNA时,Hoechst 33258与分子信标作用较弱,其荧光信号很弱;当有目标DNA存在时,分子信标与目标DNA杂交形成双链,Hoechst 33258与双链DNA作用后荧光信号显著增强。在优化条件下,目标DNA浓度在2×10-10~2×10-8mol/L范围内时,Hoechst 33258的荧光强度（ΔI）与目标DNA的浓度（C）之间具有良好的线性关系,回归方程为ΔI=3.3439C＋18.6949（R2=0.9982）,方法检出限（3σ）为9×10-11mol/L。此方法操作简单、检测速度快、灵敏度高、重现性好、检出限低。

壳聚糖/siRNA纳米粒的制备与性能研究

利用静电自组装法制备了壳聚糖/siRNA纳米粒,建立了SYBR -old核酸染料法测定siRNA复合率（CR）,并系统性考察了n（N）/n（P）比,壳聚糖分子量（Mw）、脱乙酰度（DD ）及制备环境pH 值、缓冲液浓度（Bc）对纳米粒siRNA 复合率、粒径及表面电位的影响规律. 结果表明,siRNA 复合率由n（N）/n（P）0.5时的（18.6±4.0）%快速增大至n（N）/n（P）为2时的（92.9±2.0）%,但随n（N）/n（P）增大复合率不再升高;n（N）/n（P）〈2时,难以形成稳定纳米粒,复合物表面电位为负,n（N）/n（P）由5升至150时,纳米粒粒径由（179.3±5.7）nm 增大至（235.5±8.3）nm,表面电位由（17.2±1.3）mV 升高至（23.6±0.9）mV.另外,n（N）/n（P）150时,CR 随DD 升高而升高,随Bc升高而降低;纳米粒粒径随Mw 增大而增大,随DD及缓冲液浓度（Bc）升高而减小;纳米粒表面电位随DD 升高而升高,随pH 值及Bc 升高而降低.n（N）/n（P）比对纳米粒特性及siRNA 复合率影响最为显著,调整n（N）/n（P）、Mw、DD 、pH 值及离子强度可得到siRNA 复合率在90% 以上,粒径100-300nm,表面电位15-25mV 的纳米粒.

核酸定量技术及其在生物检测中的应用

对目前主要的核酸定量方法(分光光度法、荧光染料法、PCR法、杂交定量法、高效液相色谱法等)及其在生命研究领域中的重大作用进行了述评,并着重阐述了各种核酸定量技术的原理、优缺点,及它们在转基因检测、动植物研究、医药等领域的应用现状.

有机染料作为光散射探针在分析应用中的研究进展

结合本实验室的研究工作 ,对有机染料作为光散射探针在蛋白质、核酸和金属离子测定中的应用进行了系统的评述 .结合光散射原理及有机染料的共振光散射增强理论 ,对实验中出现的现象作出解释 。

一种近红外花菁染料的合成及其应用于生物大分子的测定

合成了一种新型阴离子型近红外花菁染料，通过核磁共振及质谱验证了结构，并研究了其水溶液的光谱性质．发现在酸性条件下，蛋白的加入使该花菁染料在７７６ｎｍ处的吸收发生减色作用，因而可以作为测定血清总蛋白质的近红外生色探针．另外，还研究了其在阳离子表面活性剂作用下形成的弱荧光现场二聚体做为核酸探针的可能性．

核酸染料的应用研究进展

核酸染色是核酸研究的重要组成部分,溴化乙锭(EB)是核酸研究中常用的染料,因其自身存在的缺点,目前研究者正不断推出新的核酸染料,以期能找到可完全取代EB用于常规核酸染色的新型染料.本文对EB及近年新推出的一些新型核酸染料的特点进行了总结,并比较了它们的优缺点,为研究中选用何种染料进行核酸染色提供参考.

琼脂糖电泳中核酸染料Goldview最佳使用方案的建立

目的确定琼脂糖凝胶电泳中使用核酸染料Goldview的最佳浓度和方法,尽可能减少实验中Goldview用量,控制其对实验室环境的污染。方法配置含不同浓度Goldview的上样缓冲液,混合不同浓度DNA溶液的琼脂糖凝胶电泳,然后对比预染样品法、前染法及后染法的染色效果。结果实验结果显示上样缓冲液中含0.4%Goldview的预染样品法电泳检测核酸的效果最佳且能检测的核酸样品浓度在16.5ng或以上为最佳。结论核酸染料Goldview在核酸的琼脂糖凝胶电泳中使用的最佳方案为预染样品法,实验中推荐浓度达到普通实验要求,并且最易控制对周围环境的污染。

一种不对称菁染料及其与不同结构DNA的相互作用

为考察小分子配基与不同核酸结构的结合机理,发展新的核酸探针分子,合成了一种新型一次甲基不对称菁染料（MTP）.吸收光谱、荧光光谱及圆二色光谱研究结果表明,MTP可与平行和混合平行G-四链体DNA（如c-myc和22AGK＋）较强地结合,并引起130-180倍的荧光增强;其与单/双链DNA作用较弱,导致40-60倍荧光增强;而与反平行G-四链体DNA（如TBA和22AGNa＋）的作用最弱,只引起15-25倍荧光增强;以上结果表明MTP可作为荧光探针分子用于区别不同结构的核酸分子.结合机理研究表明,平行和混合平行G-四链体DNA优先通过沟槽结合模式结合1分子MTP,再通过末端堆积模式结合另1分子MTP.

共振瑞利散射法测定核酸探针的发展及应用

共振瑞利散射(RRS)技术以其高灵敏度、高选择性、操作简便等优点广泛应用于核酸的研究及测定。该方法中,探针的应用与发展对于核酸的测定有至关重要的影响。综述近十几年来应用于该方法中的探针发展情况及其在测定核酸中的应用进展,并对今后的发展趋势作了展望。

核酸分析中的新突破双-嵌入剂荧光探针

近年来兴起的双－嵌入剂是一类安全、方便、高灵敏度、低背景的理想核酸探针，当使用激光激发的共焦荧光扫描仪检测时，对核酸的分析可达ｐｇ级，赶上甚至超过了放射性同位素标记物．本文对双－嵌入剂荧光核酸探针的结构、性质、应用及发展展望几方面进行了综述．

4种核酸染料在实验教学中的应用研究

分别使用4种核酸染料对凝胶中质粒DNA进行染色,紫外凝胶成像仪下观察和记录结果,比较4种核酸染料对琼脂糖凝胶中DNA的染色效果,并对结果进行比较分析。结果表明,EB价格低廉,对含量为50ng以上的DNA着色效果最好,亮度较暗;而Gold view与EB相比染色效果无太大差别,但是亮度比EB稍亮;Sybrgreen在这4种核酸染料中亮度很明显,且对含量为10ng以上的DNA就有荧光呈现;Ultra power对含量为5ng以上的DNA染色效果明显,亮度最亮。由于EB有强致突变性,微毒,而后3种核酸染料基本无毒性,安全可靠,因此,本着经济、方便、可靠的原则,在实验室中用Gold view足以满足一般需要;经济允许且在做荧光定量PCR、即时PCR时,最好选用Sybr green。