狂犬病毒N基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

目的用表达的狂犬病核蛋白建立检测狂犬病抗体的间接ELISA方法。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)ERA株N基因序列设计引物,利用PCR的方法从重组质粒pMD-N中扩增RV N基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建原核表达载体pET-N。阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达并确定表达N基因的最佳诱导时间。通过凝胶薄层扫描分析和Western-blot分析确定表达蛋白的表达量和特异性。用纯化的表达产物作为诊断抗原,通过对各反应条件的优化,初步建立检测RV抗体的间接ELISA方法。结果扩增了RV N基因,构建了原核表达载体pET-N和原核表达菌,表达了N基因且目的蛋白以包涵体形式存在表达菌中,最佳诱导时间为4 h。重组蛋白表达量占菌体总蛋白的56.8%,并能与RV阳性血清发生特异性反应。用表达的狂犬病重组N蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法。结论成功表达了狂犬病核蛋白,用表达的狂犬病核蛋白建立的间接ELISA方法可以用于RV抗体的检测。

湖南省40株狂犬病毒株N基因的序列分析

目的研究湖南省40株狂犬病毒株N基因序列特征及其遗传进化关系。方法采用RT-PCR法从家犬脑组织标本检测狂犬病毒RNA,并对扩增产物N基因片断进行测序。采用DNAStar软件包中MegAlign将所得测序结果与湖南省往年20株毒株N基因进行核苷酸、氨基酸序列同源性比对分析,并以Neighbor-Joining法构建系统发生树。结果40株毒株均为基因1型,N基因核苷酸序列同源性在88.5%～100%(中位数97.9%)间,编码的氨基酸序列同源性为98.3%～100%(中位值99.6%)。系统发生分为3个组群,具有一定的地域性。结论湖南省40株狂犬病毒株间N基因变异较小,稳定性较高。

狂犬病毒aG株核蛋白和糖蛋白双表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的构建狂犬病毒aG株核蛋白(NP)和糖蛋白(GP)双表达重组质粒,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中表达核蛋白和糖蛋白。方法提取狂犬病毒RNA,应用RT-PCR方法扩增NP和GP基因,分别将其克隆到pIRES载体上,获得同时含有NP和GP基因的双顺反子重组质粒pING,并以脂质体介导法转染CHO-K1细胞,G418筛选,用ELISA和IFA检测NP和GP的表达。结果限制性内切酶分析表明重组质粒pING含有NP和GP基因片段,长度分别为1353bp和1575bp。应用ELISA和IFA方法,在转染细胞中均检测到NP和GP的表达。结论重组双表达质粒可在CHO细胞中同时表达NP和GP,为进一步开发重组狂犬病疫苗奠定了基础。

聚精颗粒联合复方玄驹胶囊治疗死精子症机制研究

目的聚精颗粒联合复方玄驹胶囊治疗死精子症的疗效观察。方法选择死精子症患者69例，给予聚精颗粒联合复方玄驹胶囊治疗3个月，治疗前后分别采用精子顶体酶定量、核蛋白组型转半定量、超氧化物歧化酶（SOD）定量和DNA荧光染色精子动（静）态图像分析系统进行检测分析，观察治疗前后精液常规参数以及顶体酶、核蛋白组型转、SOD的变化。并观察21例正常生育者上述指标作为对照。结果与治疗前相比，治疗后a级精子、a＋b级精子、e级精子百分率及精子顶体酶值均有明显改变（P〈0．01）；精子密度、精子核蛋白组型转换半定量值及精浆SOD值无明显变化（P〉0．05）。结论聚精颗粒联合复方玄驹胶囊可以明显改善死精子症患者精子活动率，但联合治疗的良好疗效可能并不体现在SOD活性值的改变。死精子症患者的精子顶体酶检测和核蛋白组型转检测有一定的价值，而SOD变化不明显。

宁波市麻疹野毒株N基因片段研究

目的探讨宁波市麻疹流行株的基因型别和遗传特征。方法利用细胞培养从宁波市2004，2005年28例临床诊断麻疹病例的咽拭子中分离麻疹病毒，通过RT-PCR扩增出病毒核蛋白（N）基因C末端456bp片段进行测序，并分析其和GenBank中麻疹病毒各基因型代表株的同源性。结果分离到8株麻疹病毒，其N基因片段与H1型代表株Hu nan．CHN的同源性为97．6％-98．5％。与麻苗Shanghai-191的同源性为92．8％-93.4％。结论宁波市麻疹流行株属于H1基因型。

H5N1亚型禽流感病毒NP基因的克隆与表达

根据已知H5N1亚型禽流感病毒NP基因序列设计、合成PCR克隆引物。自H5N1阳性病料中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶,经PCR扩增NP基因,采用Invitrogen定向表达系统进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组NP蛋白,分子质量约66.0ku。采用单克隆抗体和阳性血清经ELISA、免疫印迹分析重组蛋白的免疫反应性。结果表明:所获得的重组NP蛋白在ELISA分析中均能与阳性血清和单克隆抗体发生特异性结合,但在免疫印迹分析中仅与阳性血清发生特异性结合。

狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内的质控方法

目的探讨狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内质控方法。方法以ELISA双抗体夹心法检测狂犬病病毒抗原为例,采用“Levey-Jennings”和“即刻法”质控法进行对比。结果“Levey-Jennings”质控图中所有测定结果均处于“在控状态”,而“即刻法”质控图中一次测定结果处于“失控状态”。结论宜采用双质控方法进行狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内质控。

双歧杆菌肽聚糖对汉坦病毒NP免疫效果的影响

探讨双歧杆菌肽聚糖作为佐剂对汉坦病毒核蛋白(HTNV-NP)免疫效果的影响。提取并制备双歧杆菌肽聚糖(PG),与HTNV-NP混合,免疫接种BALB/c小鼠,检测抗体水平变化,检测IL-2、IFNγ,淋巴细胞增殖实验检测免疫应答效果。同时观察PG的安全性。注射HTNV-NP组产生平均抗体滴度(GMT值)为74.21±17.38,IL-2和IFNγ的产生水平分别为(9.32±1.21)U/L和(97.78±6.54)U/L,淋巴细胞增殖反应刺激指数(SI)为1.7;注射HTNV-NP+PG组GMT值为1276.23±94.67,IL-2和IFNγ的产生水平分别为(17.67±3.31)U/L和(154.56±10.72)U/L,淋巴细胞增殖反应SI值为3.1;而注射PBS组不产生抗体,IL-2和IFNγ的产生水平分别为(1.17±0.21)U/L和(21.90±5.12)U/L,淋巴细胞增殖反应SI值为0.2。结果显示PG可明显增强HTNV-NP的免疫效果,且未出现不良反应,是良好的疫苗佐剂。

低渗肿胀实验、苯胺蓝染色及染色质扩散实验检测精子核蛋白及膜完整性对比研究

目的通过对低渗肿胀实验(HOST)、苯胺蓝(AB)染色实验、染色质扩散(SCD)实验、脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)实验、AB/HOST实验,SCD/HOST实验、HOST/TUNEL实验的检测结果中精子活性分级进行比较,探索优化精子活性的检验方法。方法选取2012年5月—2016年10月已育成年健康男性志愿者30例。每例样本分为7组,分别为:HOST组、AB组、SCD组、TUNEL组、HOST/AB组和HOST/SCD组、HOST/TUNEL组。分别进行相应方法的染色,观察精子尾部肿胀及核蛋白、DNA受损情况,计算各级活力精子的比例。结果单独AB和单独HOST与HOST/AB比较,精子分级差异有统计学意义;单独SCD和单独HOST与HOST/SCD比较,精子分级差异有统计学意义;单独TUNEL和单独HOST与HOST/TUNEL比较,精子分级差异有统计学意义。结论 HOST/AB联合染色及HOST/SCD联合染色是对精子的核蛋白、DNA及膜完整性判断更为准确和实用的方法。

狂犬病病毒核蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

将狂犬病病毒核蛋白(N)与麦芽糖结合蛋白(MBP)在大肠杆菌中融合表达。采用Western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测该重组融合蛋白的抗原性,并建立了间接ELISA方法检测狂犬病病毒特异性抗体。ELISA结果与快速荧光抑制试验(RFFIT)检测的中和抗体进行比较,RFFIT检测的中和效价与ELISA检测的OD值相关性很好(r=0.943 6),并且ELISA的敏感性和特异性分别为93.4%和100%。

北京市1株人狂犬病病毒分离鉴定及其分子特征

目的研究北京市一株人狂犬病病毒的N、G基因的分子特征,比较与全国流行株以及疫苗株之间的差异。方法以直接免疫荧光技术检测病人脑组织,昆明乳鼠颅内接种法分离病毒株。以RT-PCR方法扩增病毒的核蛋白及糖蛋白基因,克隆测序后进行遗传学分析。结果直接免疫荧光检测到病人脑组织中的病毒颗粒,用乳鼠颅内接种法分离到了毒株,命名为Beijing(H)株。遗传分析表明Beijing(H)株与目前我国的主要流行株N基因和G基因的核苷酸序列同源性分别是97.6%～99.1%和97.5%～99.7%,推导的氨基酸序列同源性分别是97.6%～99.2%和97.7%～99.8%。结论Beijing(H)株为基因1型狂犬病毒,属于我国目前的流行株,其与目前国内所使用的疫苗株存在一定的差异。

呼吸道合胞病毒核蛋白检测抗体的筛选与鉴定

目的筛选识别呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）核蛋白（N）的单克隆抗体，并对其性质进行鉴定。方法使用大肠杆菌表达系统原核表达重组N蛋白，蛋白质纯化后免疫BALB/c小鼠。通过脾脏免疫、融合获得杂交瘤细胞，结合有限稀释法亚克隆细胞株，间接酶联免疫吸附试验（ELISA）对单克隆抗体株进行筛选，并通过蛋白质免疫印迹法（Western blot）、ELISA和间接免疫荧光技术对最终筛选的单克隆抗体进行性质鉴定，根据正交试验的结果挑选捕获能力和检测效果较好的抗体进行诊断试剂的初步调试。结果成功构建N-pTO-T7原核表达载体，并成功表达、纯化得到高纯度重组N蛋白用于小鼠免疫，最终筛选获得24株N蛋白的单克隆抗体，24株抗体均具有较好的ELISA反应性，5A2等8株抗体有较好的Western blot检测特性，11H8等13株抗体可用于间接免疫荧光检测，并获得能够实现在病毒上检测N蛋白的优选配对12F2/11H8-HRP和12F2/15A8-HRP。结论本研究成功筛选出可用于N蛋白特异性检测的单克隆抗体及抗体配对，为RSV感染机制的研究及诊断试剂的研发提供实验资料。