鸭源致病性大肠杆菌O抗原与毒力基因检测及药敏试验

【目的】探究荣昌、大足和隆昌三地鸭大肠杆菌分离株的O抗原、毒力基因及耐药性。【方法】将2014年—2021年鸭病料中分离得到的107株细菌在无菌条件下接种于麦康凯培养基中划线进行培养纯化,通过16S rDNA基因扩增测序和生化试验进行细菌鉴定,采用PCR技术对O抗原和16种毒力基因进行检测,采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行药敏试验。【结果】107株分离株鉴定为大肠杆菌;O抗原鉴定试验鉴定出9种O抗原,其中优势抗原为O78(37.00%)、O7(25.00%),O121和O145(均为15.00%),并检测到5株O78+O145和O7+O145融合株;共检测出11种毒力因子,其中强致病性毒力基因有Tsh基因(检出率为25.23%)、fyuA基因(检出率为31.78%)、estB基因(检出率为31.78%)、Vat基因(检出率为2.80%)、iucA基因(检出率为44.56%)。3种毒力基因ompA、yijP和ibeB的携带率最高,分别为100.00%、96.26%和85.98%;药敏试验结果表明分离株对氨基糖苷类药物、米诺环素和多黏菌素最为敏感,对大环内酯类药物和克林霉素耐药,分离株均为多重耐药菌,30.00%的分离株表现为7重耐药。【结论】本研究鉴定到107株鸭源致病性大肠杆菌,其致病性和耐药性较强,毒力基因携带情况和耐药性检测发现大肠杆菌的致病力与其耐药性存在一定关系;O抗原检测发现了5株新型O抗原融合株,优势O抗原不断变化,说明西南地区大肠杆菌遗传结构正发生变化,可能存在新的菌体抗原。本研究结果为中国西南地区鸭大肠杆菌病防控及疫苗制备提供依据。

细菌O抗原基因簇的研究进展

O抗原是革兰阴性菌外膜的重要组分。它是由多糖的重复单位和一系列寡糖重复单位所组成,即O抗原基本单位,一般包括2～6个糖基。因为多糖中糖的性质不同,连接次序,连接位点都有差异,因而O抗原变异很大。染色体中有关O抗原合成的基因丛集成簇。这些基因簇的变异很大,也反映了O抗原结构的多样性。O抗原的表达受到各种因素的调节。

微量凝集试验对鸡大肠杆菌O抗原血清型鉴定的研究及初步应用

为改进大肠杆菌血清型鉴定方法，用５株标准菌株在９６孔Ｕ型板上进行微量凝集试验，优选了反应及观察条件：每孔中加５０μＬ菌体抗原（浓度为１．５×１０９－２．０×１０９个菌／ｍＬ）和５０μＬＯ抗原单因子血清（稀释度从１／１０－１／８０）混合，于３７℃反应１．５－２ｈ，阳性结果可在黑色背景上清晰观察到片状凝集。试验各株均与原血清型一致。用此法对１７株来自山东某地的鸡大肠杆菌进行了血清型鉴定，结果Ｏ７８为５株，Ｏ３６５株，Ｏ１３１４株，Ｏ７０３株，与以前用常规方法对该地区菌型鉴定结果相符。

5种大肠杆菌O抗原定型血清的制备

本研究以大肠杆菌参考菌株CVCC1369(O26)、CVCC3800(O153)、CVCC1489(O157)、CVCC3739(O159)、CVCC3807(O163)为菌种制备免疫抗原并免疫家兔,获得5种大肠杆菌O抗原定型原血清,而后制备多种吸收抗原以消除5种原血清的非特异性凝集素。通过微量凝集试验的方法,确定各血清的凝集价。最终确定了5种大肠杆菌O抗原定型血清的制备方法,为进一步改进大肠杆菌O抗原定型血清的制备工艺提供了思路和依据。

弗氏志贺氏菌O抗原多糖致病性研究

志贺氏菌外膜的脂多糖(LPS)在致病和诱导免疫保护中都起重要作用。为探讨脂多糖分子外侧O抗原多糖(O-PS)的特异性致病作用,应用酶解-凝胶层析法提取和纯化弗氏志贺氏菌5型M90 T的O抗原多糖,进行了体内外实验。结果显示:M90T O抗原多糖单独对HeLa细胞具有毒性作用,对兔回肠袢粘膜有致炎和血性渗出作用。提示O抗原多糖可能是造成腹泻的特异性因素之一,不同于脂多糖的内毒素反应。

福氏志贺菌5型M90T株O抗原多糖细胞毒性作用的研究

本文提取并纯化了福氏志贺菌 5型M 90T的脂多糖 (lipopolysaccharide ,LPS)亚单位分子———O抗原多糖 (O anti genpolysaccharide ,OPS)进行体内外试验 ,并与该菌LPS作对比 ,揭示其亚单位OPS的毒性作用不同于完整LPS分子。OPS可引起HeLa细胞病变 ,而LPS不能 ;OPS可引起兔回肠襻肠粘膜出血 ,但不引起肠腔积液 ,而LPS引起肠腔积液 ,并严重损伤肠粘膜。

大肠杆菌O157∶H7 CVa9株O抗原变异的研究

目的 研究本实验室保藏的大肠杆菌O15 7:H7(E coliO15 7:H7)日本分离株CVa9O抗原的变异。方法 血清凝集试验检测CVa9菌株O和H抗原 ,区分O抗原变异株与非变异株。聚合酶链反应 (PCR)法分别检测O15 7和H7特异性基因。生化试验检测生化特性。观察菌株在麦康凯、山梨醇麦康凯、棉子糖麦康凯及ChromagarO15 7显色培养基上菌落形态 ,菌落计数法计算变异率。结果 抗 -O15 7抗血清与CVa9菌株进行玻片凝集试验出现强凝集 (CVa9- 8)和不凝集 (CVa9- 1、CVa9- 15 )两种菌落 ,试管凝集试验结果相同 ,证实不凝集菌落O抗原发生变异。抗 -HT 抗血清分别与变异株和非变异株H抗原进行试管凝集试验 ,均为强凝集。两种菌株O15 7和H7特异性基因均为阳性。变异株与非变异株生化特性基本相同 ,但变异株不发酵棉子糖。两种菌株在麦康凯及山梨醇麦康凯培养基上菌落形态特征没有区别。在ChromagarO15 7显色培养基上培养 4 8h ,变异株为浅紫红色 ,菌落周边呈毛边状 ,非变异株为紫红色 ,菌落边缘整齐。变异株在用棉子糖代替乳糖制备的棉子糖麦康凯培养基上菌落呈粉红色 ,非变异株呈红色。菌落计数显示变异率为 99 80 %。结论 CVa9菌株在保存过程中O抗原发生变异 ,菌落形态及部分生化特征亦有所改变。

链球菌溶血素O抗原的原核表达及条件优化

目的构建链球菌溶血素O抗原(SLO)的重组表达质粒,并优化其在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法以A群链球菌DNA为模板,采用PCR法扩增SLO基因,将扩增的基因连接pET-32a(+)表达载体构建pET-32a(+)-SLO重组质粒,重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,转化后的表达菌经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和自诱导的方式分别诱导及纯化,最终确定最佳的表达条件。结果 PCR扩增的基因大小与SLO基因大小一致,测序完全正确。不同浓度的IPTG诱导均为包涵体表达,且表达量均较低;自诱导的方式,不仅表达量明显提高,且实现了部分可溶性表达。结论成功构建了SLO的原核表达质粒,优化筛选出能高效可溶性表达的诱导条件,纯化获得了SLO重组融合蛋白质,为进一步的基础及临床研究应用奠定基础。

酸解——凝胶色谱法制备志贺菌O抗原多糖

本法在去除蛋白与核酸的条件下以 2 5 4nm作为脂多糖 (Lipopolysaccharide ,LPS)凝胶色谱检出波长 ,得到较高纯度志贺菌LPS。LPS经乙酸水解后 ,仍以 2 5 4nm作为O抗原多糖 (O -polysaccharide ,OPS)凝胶色谱的检出波长 ,可获得纯度优于常规方法且具较好免疫反应性的OPS ,该OPS与牛血清白蛋白 (bovineserumalbumin ,BSA)结合后具有较好免疫原性。

1株猪源大肠杆菌O抗原的鉴定及其耐药试验

为确定引起山西省长治市某规模养猪场仔猪黄痢的大肠杆菌O抗原的血清型进行了试验。明确了引起该猪场仔猪黄痢的病原为O_8血清型的大肠杆菌;为了找到治疗仔猪黄痢的有效药物,针对该株大肠杆菌做了耐药试验,发现作用明显的药物有氧氟沙星、头孢曲松、阿米卡星和呋喃唑酮,而环丙沙星、卡那霉素、利福平等多种药物作用不明显或无作用。

沙门菌常见O抗原和H抗原荧光PCR检测方法评估

目的:评估沙门菌常见A^F血清群O抗原和H抗原荧光PCR检测方法对不同血清型沙门菌的检测效果。方法:选用不同血清型沙门菌制备模板,运用沙门菌O抗原A^F群及不同H抗原荧光PCR检测试剂盒对这些菌株进行扩增检测,分别计算不同血清型检测结果的灵敏度、特异度、检测下限、假阳性率、假阴性率、Kappa值等指标并进行分析。结果:对7种不同沙门菌O抗原的检测灵敏度为85.71%~100.00%,特异度为66.67%~100.00%;对7种不同沙门菌H抗原的检测,H1,5及Hi-l的灵敏度不高,分别为35.71%及57.14%,但特异度均较高(87.50%~100.00%);经Fisher精确检验,除H1,5阳性检测的P>0.05(P=0.162),其余为P<0.05;C1、C2、D1、E、F血清群及H抗原1,6、1,7、g,s,t、g,m的检测结果与血清凝集结果的一致性较高(Kappa值均大于0.75),而H1,5及Hi-l的检测结果与血清凝集结果的一致性很差(Kappa值分别为0.302及0.492);试剂盒对不同O/H抗原核酸检测扩增效率较好,最低检出限为7~137608拷贝/反应。结论:除H1,5抗原外,该荧光PCR检测试剂盒对沙门菌O/H抗原不同血清型的检测效果较好,优于传统血清凝集方法,可显著提高血清型鉴定时效,有利于疾病或暴发的早期发现。

抗沙门氏菌O抗原特异单克隆抗体的制备及其免疫生物学特性的鉴定

本研究应用淋巴细胞杂交瘤技术制备了41株分别针对沙门氏菌O_2、O_3、O_4、O_7、O_8、O_9、O_(11)、O_(19)等O抗原的特异单克隆抗体(下称单抗)。在多种血清学试验中,这组单抗只选择性地与所试52株沙门氏菌中具有相应O抗原的菌株反应,而不与其它沙门氏菌或其它肠道杆菌反应。应用这组单抗对864个现场分离菌株的鉴定和分解结果与常规O血清的试验结果一致,表明这组单抗完全可以取代常规O血清,具有广泛的应用前景。

布鲁氏菌M28强毒株O抗原聚合酶基因缺失株的构建及其毒力评价

为构建布鲁氏菌O抗原聚合酶缺失突变株,本研究以布鲁氏菌M28株为亲本株,利用同源重组方法,以编码O抗原聚合酶靶基因M28_B0107基因ORF外侧序列作为同源臂构建重组质粒pSP-B0107-K,将其电转化至M28感受态细胞中,以卡那霉素抗性基因(Kanr)作为标记,筛选缺失突变株(M28-ΔB0107)。M28-ΔB0107经过20余代传代培养,Kanr表达稳定。将M28-ΔB0107与M28以106cfu剂量腹腔接种小鼠,进行体内致病性试验。结果显示,M28-ΔB0107感染组小鼠脾脏荷菌量显著低于亲本M28株感染组,感染6周时,前者低于后者近10倍(p<0.05);而且M28-ΔB0107感染组脾脏重量也显著低于M28强毒株组(p<0.05);小鼠腹腔巨噬细胞系(RAW264.7)感染能力试验结果表明,突变株与亲本株无明显差异(p>0.05)。

重庆市部分地区鸭源大肠杆菌的O抗原血清型及耐药性

从重庆市5个区、县的部分规模化鸭场收集以心包炎、肝周炎及腹膜炎为主要病理变化的病死鸭,无菌采取其心血和肝脏后接种,分离出30株细菌,经细菌的形态特性和生化特性分析,鉴定为大肠杆菌.该试验对分离的大肠杆菌进行了O抗原单价血清型鉴定试验及药敏试验.结果表明:30株分离菌中有23株定型分属于11种血清型,其中以O78,O93,O92和O21为优势血清型(共占46.67%).30株分离菌对21种抗生素的耐药率高于50%,其中耐受7种药物以上的有28株,占93.3%,耐受10种药物以上的有23株,占76.6%,表明重庆地区部分养鸭场鸭源大肠杆菌的耐药性严重.

福建南平发现一株新O抗原群EIEC

1990年3月,在福建南平市一轻型痢疾样患者中检出1株新型大肠埃希菌(90-312)。该菌株有大肠菌与志贺菌之间的生化特性(葡萄糖产气,无动力,靛基质、醋酸钠、萄萄糖铵阳性和赖氨酸脱羧酶阴性等),噬菌体试验裂解Sh、E4,豚鼠角膜结膜炎试验阳性,琼脂糖蛋白电泳出现120～140Md质粒带,并与福氏志贺菌2a抗血清交叉凝集。但菌株经中国药品生物制品检定所鉴定,为与国际标准株大肠菌O_1～O_(170)抗血清不凝集的肠侵袭性大肠杆菌(9C-101)。作者等暂定名为肠侵袭性大肠杆菌——中国福建株。

O抗原参与鸡的抗肠炎沙门菌先天免疫应答

欧盟采用肠炎沙门菌或鼠伤寒沙门菌弱毒株制成的沙门菌病疫苗来预防家禽沙门菌病，这一措施使得家禽感染肠炎沙门菌或鼠伤寒沙门菌的概率降低，但增加其他血清型沙门菌感染的几率。捷克共和国布尔诺兽医研究所的科研人员探讨了婴儿沙门菌与肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌与鸡免疫系统的早期互作，

应用抗O抗原单克隆抗体对692个沙门氏菌分离株的分群鉴定

应用抗沙门氏菌菌体抗原O_1、O_2、O_3、O_4、O_7、O_8、O_9,O_(11)、O_(12)、O_(19)一组单克隆抗体(单抗)对692个沙门氏菌分离株进行鉴定,结果A群4株、B群210株、C_1群61株、C_2群109株、D_1群119株、E群182株和F群7株.这一结果与用常规O血清进行的平行试验的鉴定结果一致.同时,这组单抗与172株非沙门氏菌分离菌株不反应.说明这组单抗可以取代常规O单因子血清和A-F群O多价血清用于沙门氏菌的分群鉴定。

椰毒假单胞菌种特异性O抗原因子(O-Ⅰ)的研究

本研究证明椰毒假单胞菌及其酵米面亚种具有共同的种特异性抗原子O—Ⅰ。经检测,由不同地区、不同样品中分离的67株椰酵假单胞菌均含有O—Ⅰ抗原。O—Ⅰ抗原的确证及其单克隆抗体的建立均为国内外首次报告,分泌抗O—Ⅰ因子单克隆抗体的细胞株P.co65的建立为椰酵假单胞菌的鉴定及该菌引起食物中毒病原学的快速诊断提供了有力的工具。

肠侵袭性大肠埃希菌O抗原多糖的致病作用

目的研究肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)O抗原多糖(OPS)的特异性致病作用。方法提取并纯化大肠埃希菌O29———EIEC的脂多糖(LPS)亚单位分子———OPS进行体内外试验,观察其毒性作用并与LPS作对比。结果EIECOPS可引起HeLa细胞病变;致兔回肠袢肠黏膜出血,但不引起肠腔积液;电镜观察OPS致病变的HeLa细胞,明显可见细胞的超微病理损害。结论EIECOPS有特异的致病作用,与其LPS的内毒素作用不同;大肠埃希菌O29(致病菌株)OPS毒性作用比大肠埃希菌HB101(非致病菌株)OPS毒性强烈。

二重PCR检测甲型副伤寒沙门菌H1及O抗原基因的研究

目的:建立特异、快速检测甲型副伤寒沙门菌的二重PCR法,应用于临床甲型副伤寒的快速诊断及流行病学溯源。方法:根据甲型副伤寒沙门菌1相鞭毛蛋白抗原(H1抗原)fliC-a基因及菌体抗原(O抗原)rfbS基因的核酸序列设计2对特异性引物,采用二重PCR法检测甲型副伤寒沙门菌标准株、非甲型副伤寒沙门菌标准株及甲型副伤寒沙门菌临床株。结果:实验结果证实,甲型副伤寒沙门菌标准株及临床株应用二重PCR方法均成功扩增出预先设计的2条特异性目的条带。结论:所建立的二重PCR法较之传统细菌检验方法具有快速、特异、敏感及简便之优势,可用于甲型副伤寒的早期诊断。