外源性硫化氢对嗜铬细胞瘤细胞β位淀粉样前体蛋白裂解酶1表达的影响

目的观察外源性硫化氢(H2S)对嗜铬细胞瘤细胞(PC12)β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)表达的影响,并探讨可能涉及的细胞信号机制。方法用不同浓度的硫氢化钠(NaHS)处理体外培养的PC12细胞,利用RT-PCR和Western blot法检测细胞内BACE1mRNA及蛋白表达;继以LY294002和PD98059分别阻断磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3-K/Ak)t及丝裂酶原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶1/2(MAPK/ERK1/2)通路,Western blot法检测其对NaHS诱导的通路下游蛋白Akt1和ERK1/2磷酸化的影响及其对BACE1蛋白表达变化的调节;ELISA法检测细胞培养液中Aβ42水平的变化。结果 NaHS在实验浓度范围内呈剂量依赖性下调BACE1mRNA及蛋白表达,200μmol/L时最明显,各NaHS组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);LY294002抑制NaHS诱导的Akt1蛋白磷酸化,削弱NaHS对BACE1蛋白的下调作用,其表达在LY294002预处理组与NaHS200μmol/L组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);而PD98059虽能抑制NaHS导致的ERK1/2蛋白磷酸化,但对其调节BACE1蛋白表达无影响,PD98059预处理组与NaHS200μmol/L组相比,差异无统计学意义(P>0.05);不同处理条件下的Aβ42表达与BACE1变化趋势基本一致。结论外源性H2S下调PC12细胞BACE1表达,其机制可能与PI3-K/Akt信号通路的激活有关,而与MAPK/ERK1/2通路无关。

药物中间体S-苯基-L-半胱氨酸的酶法合成

目的利用在大肠杆菌中高效重组表达的O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶A(OASS-A)合成药物中间体S-苯基-L-半胱氨酸,并对合成产物进行纯度及结构鉴定。方法通过PCR扩增目的基因Cys K,并连接到pET-22b(+)载体上构建原核表达质粒,重组体转到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达,重组蛋白采用Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,利用SDS-PAGE鉴定表达纯化蛋白,通过HPLC对合成产物纯度进行检测,应用1H NMR技术对化合物进行结构鉴定。结果成功构建了OASS-A原核表达载体,在IPTG诱导下获得了高效表达。重组酶高效合成非蛋白质氨基酸S-苯基-L-半胱氨酸。合成的化合物以晶体形式析出,采用HPLC和1HNMR技术对其结构进行了鉴定,合成产物的纯度为100%。结论利用大肠杆菌中重组表达的OASS-A能够高效合成药物中间体S-苯基-L-半胱氨酸。

鱼腥草对金黄色葡萄球菌生物被膜干预作用研究

研究鱼腥草水提物对金黄色葡萄球菌生物被膜的干预作用。采用微量肉汤稀释法测定鱼腥草水提物对金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003的最低抑菌浓度;采用结晶紫染色法、扫描电镜及激光共聚焦显微镜评估鱼腥草水提物对CMCC(B)26003生物被膜形成的影响;最后采用实时荧光定量PCR方法测定鱼腥草水提物对O-乙酰丝氨酸硫化氢裂解酶B(O-acetylserine sulfhydrylase-B)cysM基因转录的影响。结果显示,鱼腥草水提物在12.500 mg/mL、6.250 mg/mL、3.125 mg/mL质量浓度下均可以有效抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成,在12.500 mg/mL质量浓度下可下调cysM基因的表达。鱼腥草可能通过下调cysM基因的表达而抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。

大肠杆菌cysE和cysM基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】克隆大肠杆菌半胱氨酸合成酶(包括丝氨酸乙酰转移酶(cysE)和O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysM))的基因,对其进行原核表达,并制备相应蛋白的抗体。【方法】用PCR方法从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增cysE和cysM基因,构建其原核表达载体pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM,对其进行BamHⅠ和SacⅠ双酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot(以His抗体作为一抗)检测。用纯化的cysE和cysM蛋白作为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价。【结果】PCR获得了822bp的cysE基因和912bp的cysM基因。原核表达质粒pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM构建成功,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的cysE和cysM重组蛋白分子质量分别为56和58ku。制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性,抗体滴度均达到1∶102 400。【结论】成功克隆了大肠杆菌cysE和cysM基因,并实现了原核表达,同时制备出了相应的多克隆抗体。

硫素营养水平对大豆籽粒OAS-TL表达的影响

大豆氧乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶(OAS-TL)催化半胱氨酸合成,是硫素代谢的关键酶。试验以东农46(高油型)和黑农35(高蛋白型)为材料,检测鼓粒期后大豆籽粒OAS-TL在3个不同硫水平(0、0.02、0.08g·kg-1土)下的生理特性,鉴定克隆了该酶基因并分析了其调控表达情况。结果表明,①OAS-TL活性随生育进程推进持续下降,2个品种籽粒OAS-TL活性表现为S20高于S0和S80处理;鼓粒前期施硫效果大于后期;②通过同源克隆获得一个编码OAS-TL基因的cDNA序列,全长1059bp,ORF长855bp,编码34.2ku的蛋白质;③半定量RT-PCR显示OAS-TL稳定态mRNA在籽粒发育早期表达较强,且处理间差异明显,发育后期表达水平逐渐降低。不同硫素处理间OAS-TL的表达有差异,S20上调表达高于S0和S80。