产O-乙酰高丝氨酸的大肠杆菌构建与发酵测试

O-乙酰高丝氨酸(OAH)是具有潜在工业应用价值的前体化合物,可用于制备高丝氨酸与蛋氨酸等。以一株改造自苏氨酸产生菌的Escherichia coli Thr L为出发菌株,过表达OAH合成途径中的关键酶高丝氨酸脱氢酶基因thr A和高丝氨酸乙酰基转移酶基因met X,并利用不同强度的启动子组合优化这两个基因的表达水平,通过发酵培养基中的苏氨酸和酵母粉的浓度优化以提升OAH的产生菌株的生产性能。通过启动子组合优化结果发现,当thr A与met X均采用J23110启动子时,该重组菌株E.coliOAH4的OAH合成能力最强,摇瓶发酵50 h后,其OAH产量为1.54 g/L。当苏氨酸的浓度为2 g/L,酵母粉的浓度为6 g/L时,E.coli OAH4的发酵水平最高,摇瓶发酵50 h后,OAH的产量可进一步提升至1.98 g/L。本研究首次在E.coli中实现了OAH的合成,并通过发酵优化确定了OAH的最优发酵条件,为后续OAH生产应用研究奠定了基础。

高效液相色谱法对N-乙酰-L-酪氨酸生产工艺的中间物监控分析

为了探讨在生产N-乙酰-L-酪氨酸时,中间物料对产品质量的影响,试验研究了在采用乙酸酐乙酰化生产N-乙酰-L-酪氨酸过程中,对中间产生物料L-酪氨酸、N-乙酰-L-酪氨酸和N,O-二乙酰-L-酪氨酸的中控分析并测定它们的含量。具体方法是:把样品用超纯水稀释100倍后,在色谱柱(C_(18),150mm×4.6mm,5μm)上进行分离,以10mmol·L^(-1)磷酸盐(pH3.0)-甲醇(60:40,V/V)为流动相进行等度洗脱,在波长270nm处进行紫外检测。结果表明:L-酪氨酸、N-乙酰-L-酪氨酸、N,0-二乙酰-L-酪氨酸的质量浓度分别在10~1000mg·L^(-1),10~1000mg·L^(-1),50~1000mg·L^(-1)内与对应的峰面积呈现线性关系,检出限(3S/N)分别为1.1mg L^(-1),1.2mg·L^(-1),14.0mg·L^(-1);对实际样品进行加标回收试验,回收率分别在98.4%~105.0%,98.5%~100.8%,98.9%~100.5%之间,测定值的相对标准偏差RSD(n=6)分别为1.8%、0.7%和0.9%,均小于2.0%。说明所建立的高效液相方法切实可行,重现好,精密度高,可用于乙酰酪氨酸生产工艺中间物的监控分析。

O-酰基化丝氨酸的合成及其对樱桃番茄乙烯合成量和果实硬度的影响

通过L-丝氨酸与不同的酰氯在室温下反应,合成了8个未见文献报道的乙烯合成抑制剂O-酰基化丝氨酸(2a^2h),其结构通过核磁共振氢谱、碳谱及高分辨质谱确证。以氨乙氧乙烯基甘氨酸(aminoethoxyvinylglycine,AVG)为阳性对照,测定了目标化合物对樱桃番茄Lycopersivon esculentum Mill.乙烯合成量和果实硬度的影响,同时运用分子对接的方法分析了目标化合物与番茄1-氨基环丙烷羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC)合成酶(ACS,1IAY)可能的结合模式。结果显示:大部分目标化合物具有延缓樱桃番茄果实软化和抑制乙烯合成的作用,其中化合物2c和2h效果较为突出。用2c和2h处理番茄后第5天,与空白对照相比,果实硬度分别提高27.62%和40.04%,均与AVG处理无显著性差异;2c和2h对乙烯合成量的抑制率分别达71.89%和53.28%,其中2c处理的抑制效果显著优于AVG处理。分子对接方法分析结果表明:化合物2c与番茄ACS酶活性空腔的氨基酸残基有较好的相互作用,2c的羧基可与Ala54和Arg412的氨基形成氢键,从而占据ACS酶的活性空腔。O-酰基化丝氨酸类化合物结构简单,容易获取,对乙烯合成抑制剂的开发具有推动作用。

重氮乙酰丝氨酸诱导大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变及其K-ras基因突变的实验研究

建立大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变的动物模型，了解该癌前病变及Ｋｒａｓ 基因突变的情况 雄性Ｗｉｓｔａｒ 大鼠单次腹腔注射重氮乙酰丝氨酸３０ｍｇ／Ｋｇ 体重，４ 个月后常规取胰腺组织行光镜和电镜检查，并应用ＰＣＲＳＳＣＰ法检测Ｋｒａｓ 基因突变情况 大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变发生率１００％ ，Ｋｒａｓ 基因突变率４２－１ ％ 。重氮乙酰丝氨酸可成功诱导大鼠胰腺腺泡细胞癌癌前病变，Ｋｒａｓ 基因突变在此过程中属早期事件。

DL-丝氨酸乙酰化合成的研究

光学活性丝氨酸具有特殊的生理功能,在食品、医药领域具有广阔的应用前景,目前尚未国产化,其研究开发日益受到人们的重视。化学合成的N-氯乙酰基-DL-丝氨酸经固定化酶拆分成L-丝氨酸和D-丝氨酸。探讨了DL-丝氨酸的乙酰化方案并进行了乙酰化实验,确定了以氯乙酰氯为酰化剂酰化实验工艺参数,包括pH、反应物配比、反应温度等。

角叉菜丝氨酸乙酰转移酶的分子克隆及生物学特性分析

丝氨酸乙酰转移酶(SAT,EC 2.3.1.30)是硫同化中非常重要的一个酶,是半胱氨酸合成的关键酶,催化丝氨酸转化为氧乙酰丝氨酸的反应,后者再生成半胱氨酸。本研究从红藻门杉藻科角叉菜(Chondrus crispus)c DNA文库中克隆了角叉菜丝氨酸乙酰转移酶基因(cys E)全长序列(Gen Bank序列号KT963952)。序列分析表明,其ORF区长1143 bp,编码由380个氨基酸组成的蛋白,理论分子量为40.60 k Da,理论等电点为6.26。生物信息学分析表明角叉菜SAT与其他物种的SAT的氨基酸序列具有较高的同源性。本研究为探讨SAT在角叉菜硫代谢中的作用提供了实验基础。

N-乙酰半胱氨酸对人离体中性白细胞释放超氧阴离子的影响

目的用人离体中性白细胞研究N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)对中性白细胞释放超氧阴离子的影响。方法细胞色素C还原法测定NAC对三种刺激剂介导的中性白细胞释放超氧阴离子量。用抗原抗体法检测丝或苏氨酸磷酸化。结果NAC可呈浓度依赖性抑制N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)和佛波豆蔻醚乙酸盐(PMA)介导的中性白细胞释放超氧阴离子;而对花生四烯酸(AA)介导的中性白细胞释放超氧阴离子无影响。Western blot结果显示NAC可呈浓度依赖性抑制fMLP和PMA介导的丝氨酸或苏氨酸的磷酸化。结论NAC可能通过膜受体通道抑制细胞内的蛋白激酶C及其上游的蛋白质激酶,抑制中性白细胞释放超氧阴离子的产生。

N-乙酰半胱氨酸眼液对无痛LASEK术后角膜组织的影响

目的观察N-乙酰半胱氨酸眼液对无痛LASEK术后角膜组织修复的影响。方法采用随机对照方法,将2012年10月01日~12月31日,72例(144眼)无痛LASEK分为对照组,将2013年10月01日~12月31日,79例(158眼)无痛LASEK分为试验组.试验组加用N-乙酰半胱氨酸眼液,其他与对照组相同,用药7d,分别于术后7d、1月,观察丝状角膜炎发生情况。结果丝状角膜炎情况:对照组12眼,试验组2眼,(2=124.19,<0.001),有显著性差异。结论 N-乙酰半胱氨酸眼液有益无痛LASEK术后角膜组织的修复。

乙酰半胱氨酸对LPS诱导肺泡上皮细胞氧化应激反应迁移和EMT进程的抑制作用机制研究

目的探讨乙酰半胱氨酸(NAC)对脂多糖(LPS)诱导肺泡上皮细胞A549氧化应激、迁移、上皮间充质转化(EMT)及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路的调控作用。方法体外培养肺泡上皮细胞A549,分为NC组(不进行干预)、LPS组(10μg·mL^(-1)LPS)、NAC组(10μg·mL^(-1)LPS+1 mmol·L^(-1)NAC)、A组(10μg·mL^(-1)LPS+100 ng·mL^(-1)PI3K/AKT通路激活剂胰岛素样生长因子(IGF)-Ⅰ)、NAC+A组(10μg·mL^(-1)LPS+1 mmol·L^(-1)NAC+100 ng·mL^(-1)IGF-Ⅰ)和NAC+Y组(10μg·mL^(-1)LPS+1 mmol·L^(-1)NAC+5μmol·L^(-1)PI3K/AKT通路抑制剂LY294002),LPS和NAC分别作用24 h。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定细胞活力,丙二醇(MDA)试剂盒检测MDA表达,超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测SOD表达,划痕法检测细胞迁移率,蛋白免疫印迹(WB)法测定PI3K、AKT、磷酸化(p)-PI3K、p-AKT、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)以及波形蛋白(vimentin)的表达。结果根据细胞活力情况选择1 mmol·L^(-1)浓度NAC进行后续实验。与NC组相比,LPS组SOD表达、E-cadherin、p-PI3K和p-AKT蛋白水平降低,MDA表达、细胞迁移率、N-cadherin和vimentin蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与LPS组相比,NAC组和A组扭转了上述指标的变化,差异有统计学意义(P<0.05);与NAC组相比,NAC+A组中的IGF-I增强了NAC对A549细胞的作用,NAC+Y组中的LY294002削弱了NAC对A549细胞的作用(P<0.05)。结论NAC可抑制LPS诱导的肺泡上皮A549细胞的氧化应激反应和迁移能力,并阻碍其EMT进程,其作用机制可能与PI3K/AKT通路的活化有关。

植物半胱氨酸合成酶复合体(SAT/OAS-TL)研究进展

综述了植物半胱氨酸的合成调节和半胱氨酸合成酶复合体的结构、调节机理及其植物转基因的研究进展。

Pgk和ilvN基因对谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响

为增加谷氨酸棒杆菌A36的L-丝氨酸合成途径的碳流,首先过表达磷酸甘油酸激酶(pgk),以增加前体物质3磷酸甘油酸的积累,但经发酵分析发现其对菌株A36的L-丝氨酸产量无显著影响。进一步敲除副产物L缬氨酸合成途径的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因ilvN,敲除该基因后L-缬氨酸只有微量积累,但重组菌并未形成营养缺陷型菌株,L-丝氨酸的产量反而下降,分析发现L-缬氨酸的存在在一定程度上有助于L-丝氨酸的生成。在培养基中分别添加不同质量浓度的L-缬氨酸,在L-缬氨酸添加量为750mg/L时,重组菌L丝氨酸产量达到34.19g/L,糖酸转化率为0.34g/g,生产强度为0.28g/(L·h),相比出发菌株A36分别提高了11.8%、13.3%和12.0%。

微生物法制备L-半胱氨酸及其代谢调节研究进展

L-半胱氨酸在食品、医药和化妆品等行业中得到广泛应用。本文综述了微生物法制备L-半胱氨酸的研究进展,分析了L-半胱氨酸的代谢调节策略,对微生物法生产L-半胱氨酸具有很大的参考价值。

植物中一组杂环取代的丙氨酸衍生物研究进展

本文对含羞草氨酸、使君子氨酸、黧豆素、西瓜子氨酸等9种丙氨酸衍生的非蛋白氨基酸的种属分布、生物合成及生理活性研究作综述,并对进一步研究作简单讨论。

过表达乙酰肝素酶对胆囊癌细胞增殖及PI3K/AKT信号通路的影响

目的探讨过表达乙酰肝素酶(HPSE)对胆囊癌细胞系GBC-SD细胞增殖及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/AKT)信号通路的影响。方法构建HPSE真核表达载体,然后获得转基因过表达HPSE的胆囊癌细胞株GBD-SD。通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot分析GBC-SD和GBD-SD中HPSE mRNA和蛋白表达。通过集落形成实验、MTT来评估各组细胞的增殖情况。采用Western blot分析PI3K/AKT信号通路相关蛋白(p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT)的水平。结果成功转染后的GBD-SD中HPSE mRNA水平和蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与正常表达HPSE的GBC-SD相比,过表达HPSE的GBD-SD细胞光密度(OD)值和集落形成能力提高,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示,与GBC-SD细胞相比,过表达HPSE的GBD-SD组细胞p-AKT、p-PI3K蛋白表达水平、p-AKT/AKT值和p-PI3K/PI3K值增加,差异有统计学意义(P<0.01),而总AKT和总PI3K蛋白表达水平无明显变化。GBC-SD细胞经PI3K/AKT通路特异性抑制剂LY294002处理2 d后,其增殖能力和p-AKT/AKT值降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论过表达HPSE能够促进GBC-SD细胞的增殖,这一效应可能与PI3K/AKT信号通路有关。

毕赤酵母含硫氨基酸生物合成途径

含硫氨基酸是所有生物生长繁殖不可缺少的氨基酸。尽管毕赤酵母在工业发酵中作为重要的表达菌株,但是其含硫氨基酸的生物合成途径尚未明了。作者采用生物信息学及表型分析的方法,阐明了毕赤酵母含硫氨基酸的生物合成途径。结果表明,毕赤酵母可通过O-乙酰同丝氨酸及O-乙酰丝氨酸与无机硫元素合成含硫氨基酸,甲硫氨酸与半胱氨酸也可通过转硫途径实现相互转化。另外毕赤酵母cys3Δ突变菌株在未添加半胱氨酸的合成培养基中对硒代甲硫氨酸表现出显著的抗性。综上所述,未来有望应用毕赤酵母表达硒蛋白用于蛋白质三级结构的分析。

从蛋白质糖基化的结构到功能:以丝氨酸/苏氨酸O-(N-乙酰)葡糖胺修饰为例

糖基化作为一种重要的翻译后修饰广泛存在于蛋白质上,对蛋白质的结构和功能具有重要的调控作用。这些糖基化可以发生在各种氨基酸侧链上,且具有很高的结构多样性。然而,在生命科学与化学生物学相关学科的本科生教学中,蛋白质的糖基化修饰却常常被忽略。基于对丝氨酸/苏氨酸O-(N-乙酰)葡糖胺修饰愈发深入的了解,本文将从该修饰的发生、特性和生物学功能等方面进行阐述,通过与磷酸化修饰这一普遍存在的修饰模式的比较,阐明其对于教学和科研的重要性。

N-乙酰半胱氨酸对高氧肺损伤保护机制与p38丝裂素活化蛋白激酶途径的相关性研究

目的 观察p38丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）信号途径在高氧肺损伤中的表达,探讨N-乙酰半胱氨酸（NAC）在高氧肺损伤中的保护作用及机制.方法 将30只幼年Wistar大鼠按随机数字表法分为空气对照组（A组）、高氧暴露组（B组）、高氧＋NAC干预组（C组）、高氧＋p38MAPK特异性抑制剂（SB203580）干预组（D组）、高氧＋NAC＋SB203580联合干预组（E组）,每组6只.实验7 d后,光镜下观察肺组织病理改变,并行肺损伤评分;测定肺湿/干重（W/D）比值、支气管肺泡灌洗液（BALF）中总蛋白（TP）含量、肺通透系数;采用免疫组化法检测磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）在肺组织中的分布;用蛋白质免疫印迹法检测p-p38MAPK蛋白含量.结果 与A组比较,高氧各组均有不同程度的肺损伤,但药物干预各组（C、D、E组）肺损伤均较B组有所减轻.免疫组化显示,高氧各组p-p38MAPK阳性表达较A组明显增强,尤高表达在炎性浸润细胞;药物干预后（C、D、E组）p-p38MAPK阳性细胞较B组明显减少.蛋白质免疫印迹法显示,B组p-p38MAPK蛋白含量明显高于A组（0.20±0.03比0.11±0.01,P〈0.05）;干预后C、D、E组p-p38MAPK蛋白含量低于B组（0.16±0.02、0.15±0.01、0.14±0.02比0.20±0.03,均P〈0.05）,但仍高于A组（均P〈0.05）,而C、D、E组间则无明显差异.各组肺W/D比值、BALF中TP含量、肺通透系数改变与p-p38MAPK蛋白含量变化趋势一致.结论 高氧应激可激活损伤肺组织p38MAPK活性;NAC抗氧化肺保护作用机制可能是通过下调高氧诱导p38MAPK的激活而对肺损伤起保护作用.

天津工业生物所在代谢工程改造大肠杆菌生产甲硫氨酸前体O-乙酰高丝氨酸方面取得新进展

L-甲硫氨酸是一种重要的含硫氨基酸,广泛应用于饲料,食品,医药以及化妆品等领域,年需求量超过200万吨。目前,甲硫氨酸主要通过化学合成的方法进行生产。随着能源和环境危机的日益严峻,利用环境友好的微生物发酵法合成L-甲硫氨酸的研究越来越受到关注。O-乙酰高丝氨酸(OAH)是L-甲硫氨酸合成的重要前体,能够在乙酰高丝氨酸巯解酶的作用下直接与甲硫醇反应生成L-甲硫氨酸。基于上述工艺路线,一种偶联发酵-酶转化的工艺路线已被开发应用于L-甲硫氨酸的工业生产中,并具有较高的产率。在该工艺中,通过发酵法合成OAH是制约L-甲硫氨酸生产和降低成本的关键因素之一。此外,OAH还可用于其他高附加值产品如丁内酯等的生产,是一种有前途的平台化学品。