肠分化细胞黏蛋白O-型糖链合成抑制导致MUC2表达减低以及对细菌侵袭易感

目的探讨O-型糖链合成的抑制对肠分化细胞内细菌侵袭数量和细胞内MUC2表达水平的影响。方法对肠分化细胞(HT-29-Gal)用O-型糖链抑制剂(benzyl-N-acetyl-α-D-galactosaminide,benzyl-α-GalNAc)处理,采用Real-time PCR和Western blot检测MUC2 mRNA和蛋白的表达情况。并将HT-29-Gal细胞及benzyl-α-GalNAc处理的HT-29-Gal细胞分别与肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)和肠出血性大肠杆菌(EHEC O157∶H7)37℃孵育2 h,再加入100μg/mL的庆大霉素,杀灭细胞外及粘附于细胞表面的细菌。最后采用系列稀释克隆计数法观察benzyl-α-GalNAc处理的HT-29-Gal细胞对细菌侵袭的影响。结果 Real-time PCR和Western blot检测发现经benzyl-α-GalNAc处理的HT-29-Gal细胞MUC2的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。侵袭入benzyl-α-GalNAc处理的HT-29-Gal细胞的EPEC和EHEC O157∶H7的数量较对照细胞显著增加(P<0.05)。结论抑制HT-29-Gal细胞黏蛋白O-型糖链的合成导致侵袭入细胞内细菌数量增加和MUC2的表达降低。

Core 2和Core 4 O-型糖链参与大肠杆菌对肠上皮细胞的黏附与侵袭

目的探讨大肠杆菌对Core 2和Core 4 O-型糖链合成障碍的肠上皮细胞的黏附和侵袭的影响。方法采用针对C2GnT-2的干扰质粒和对照质粒对结肠癌HT-29细胞进行转染,通过G418筛选建立稳定转染的细胞系,采用Realtime PCR和Western blot方法检测干扰效率,选取干扰最有效的稳定细胞系与肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)和肠出血性大肠杆菌(EHEC O157∶H7)37℃共培养。最后采用系列稀释克隆计数法观察干扰Core 2和Core 4 O-型糖链合成的C2GnT-2的HT-29细胞对细菌黏附及侵袭的影响。结果成功筛选获得shRNA-C2GnT-2及shRNA-Ctr稳定转染的HT-29细胞。Real-time PCR和Western blot检测证实干扰质粒能够有效地抑制HT-29细胞内C2GnT-2的mRNA及蛋白水平表达(P<0.01),黏附于shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞表面的EPEC或EHEC O157∶H7的数量较对照细胞显著减少(P<0.01,P<0.05),而侵袭入shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞内的EPEC或EHEC O157∶H7的数量较对照细胞显著增加(P<0.01,P<0.05)。结论 Core 2和Core 4 O-型糖链参与了肠上皮细胞细菌的黏附与侵袭。

Core 3 O-型糖链参与大肠杆菌对肠上皮细胞黏附和侵袭的影响

目的探讨Core 3 O-型糖链对大肠杆菌黏附和侵袭肠上皮细胞的影响。方法通过慢病毒转染技术,获得β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶6(β3gnT6)稳定过表达的肠上皮细胞株(β3gnT6/HT-29和β3gnT6/LS174T)及其对照细胞株(Ctr/HT-29和Ctr/LS174T)。上述细胞株与肠致病性大肠杆菌(EPEC)和肠出血性大肠杆菌(EHEC O157∶H7)共培养,采用细菌梯度稀释克隆计数和荧光显微镜直接观察法,计数黏附于细胞表面的细菌数;上述细胞株与侵袭性大肠杆菌(EIEC)共培养2 h,通过庆大霉素杀灭黏附于细胞表面的细菌,再采用细菌梯度稀释克隆计数法,计数侵袭入细胞内细菌数。最后通过测定单层细胞跨膜电阻值(TEER),评价Core 3 O-型糖链对肠上皮细胞屏障功能的影响。结果细菌克隆计数和荧光显微镜直接观察法均显示,黏附于β3gnT6/HT-29和β3gnT6/LS174T细胞株的EPEC和EHEC O157∶H7少于其对照细胞(P<0.01或P<0.05);侵袭入β3gnT6/HT-29和β3gnT6/LS174T细胞株的EIEC高于其对照细胞(P<0.01或P<0.05);在EPEC或EHEC O157∶H7感染条件下,不同时间点上均呈现出β3gnT6/HT-29和β3gnT6/LS174T细胞株的TEER下降值高于其对照细胞(P<0.01或P<0.05)。结论促进肠上皮细胞Core 3 O-型糖链表达将抑制大肠杆菌黏附于肠上皮细胞,同时对大肠杆菌侵袭易感。

基于寡糖代谢工程的正常和肿瘤细胞中Mucin型O-糖链的质谱定性定量比较分析

基于寡糖代谢工程结合质谱技术(MS结合MS/MS),对4种肿瘤细胞系和1种正常细胞系中的O-糖链进行了定性和相对定量比较分析.结果表明,4种肿瘤细胞系HeLa,SMMC-7721,HepG2和MCF-7中分别检测到19,11,6和5条O-糖链;在正常肝细胞系L02中检测到10条O-糖链.在对肿瘤和正常细胞系中表达的O-糖链进行定性和相对定量比较中发现,结构组成为N1,H1N1A1和H1N1A2的3种糖链在5种细胞系中均有表达;肿瘤细胞系表达的O-糖链的种类比正常细胞多,且岩藻糖基化和唾液酸化程度均高于正常细胞组.肿瘤细胞系中特有的O-糖链主要有岩藻糖化和唾液酸化修饰的Mucin型Core2结构糖链.MS/MS分析表明,其中岩藻糖基化修饰的O-糖链结构组成为H3N3F1A2,H4N4F1A2和H5N5F1A1,唾液酸化修饰的O-糖链结构组成为H5N4A1,H4N4A2和H5N5A2.