O⁃连接⁃N⁃乙酰葡糖胺糖基化蛋白质的富集方法

O-连接-N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)糖基化修饰是将N-乙酰葡萄糖胺添加到细胞核和细胞质蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基上的一种丰富的、独特的翻译后修饰,与癌症、神经退行性病变和糖尿病等疾病密切相关。明确O-GlcNAc修饰位点是探究其在相关疾病中调控机制的前提,同时也是临床诊断和靶向干预的关键。本文介绍了近年来O-GlcNAc糖基化修饰与疾病之间的关系以及相关修饰位点的富集方法,包括抗体和凝集素、化学酶法、亲水作用液相色谱法和非天然糖代谢标记等;此外,“凹凸理论”、“定点活化”等靶向标记特定组织内蛋白质的糖基化修饰策略已成为当前研究热点,同时基于“一石多鸟”的多功能酶法标记,以及“一锅法”分析多种糖链结构等方法也将极大促进糖蛋白组学的快速发展。总之,开发更加高效、特异的糖蛋白富集策略,将对阐明包括O-GlcNAc在内的异常糖基化修饰在相关疾病中的调控机制具有重要的研究意义。

O-连接的N-乙酰葡糖胺糖蛋白的研究进展

O-连接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修饰是普遍存在的翻译后修饰。已有许多的蛋白被发现是O-GlcNAc蛋白。目前,许多分析方法可以检测O-GlcNAc,将其从内膜系统的多种糖基化中区分出来。O-GlcNAc修饰在细胞事件中发挥着重要的功能,O-GlcNAc的调控异常可能会引起某些人类疾病,如癌症、阿尔茨海默病和II型糖尿病。杆状病毒GP41蛋白也是糖蛋白,它介导芽殖型病毒粒子(budded virus,BV)的核衣壳通过胞核。O-GlcNAc的调控研究为探讨GP41蛋白O-Glc-NAc的调控作用提供了参考模式。

蛋白质O-连接-N-乙酰葡萄糖胺修饰在心力衰竭中的作用的研究进展

蛋白质O-连接-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰是细胞内普遍存在的重要蛋白质翻译后修饰,对于细胞生物学功能至关重要。这种翻译后修饰可影响细胞的翻译与转运,对维持和促进正常细胞发挥功能有重要意义。蛋白质O-GlcNAc修饰对心脏组织有重要作用,短期内增加的蛋白质O-GlcNAc对心脏有保护作用,而长期增加的蛋白质O-GlcNAc导致心脏功能障碍。蛋白质O-GlcNAc修饰在心血管疾病中的辅助治疗作用已成为当前研究热点。现就蛋白质O-GlcNAc修饰在心力衰竭中的作用的研究进展进行综述。

O-连接N-乙酰葡糖胺转移酶抑制剂的筛选与活性分析

利用药物发现软件Discovery Studio 4.5(DS),以基于结构的虚拟筛选天然产物化合物库的方法,获得O-连接N-乙酰葡糖胺转移酶(OGT)天然产物抑制剂阿曼托双黄酮(AF).AF能够在体外抑制OGT的酶活.分子动力学(MD)模拟实验结果表明,AF能够稳定结合在OGT蛋白的底物结合口袋中,并与口袋附近多个氨基酸形成氢键.细胞内活性检测结果表明,AF能够有效抑制蛋白质的O-GlcNAc修饰,具有良好的OGT抑制活性.

杏仁核O-连接的β-N-乙酰葡糖胺糖基化修饰对应激弹性的调节作用

目的探讨杏仁核O-连接的β-N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修饰水平对应激弹性的影响。方法采用束缚法建立小鼠应激模型,将小鼠束缚24 h、休息7 d后进行悬尾、强迫游泳和条件恐惧等行为学实验;之后处死小鼠,分离海马、皮质和杏仁核脑区,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各脑区O-GlcNAc修饰水平。通过脑立体定位技术注射O-GlcNAc水解酶(OGA)抑制剂、O-GlcNAc转移酶(OGT)抑制剂、OGA和OGT腺相关病毒调节杏仁核区内O-GlcNAc修饰水平,观察对应激后行为学的影响。结果束缚应激小鼠的焦虑、抑郁样行为和负性记忆明显增强。同时,杏仁核内O-GlcNAc修饰水平显著降低,与行为表现显著负相关。应激弹性小鼠杏仁核O-GlcNAc修饰水平显著高于敏感小鼠。杏仁核内注射OGA抑制剂或OGT腺相关病毒上调O-GlcNAc修饰水平,可降低应激小鼠的抑郁样行为,提高小鼠的应激弹性;杏仁核内注射OGT抑制剂或OGA腺相关病毒下调O-GlcNAc修饰水平,可增加应激小鼠的抑郁样行为,降低小鼠的应激弹性。结论杏仁核O-GlcNAc修饰水平对调控束缚后小鼠应激弹性具有重要作用。

O-GlcNAc修饰与肿瘤发生及转移

O-连接的β-N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修饰是一种广泛存在于细胞浆和细胞核蛋白质丝/苏氨酸上的动态、可逆的翻译后修饰.这种修饰与经典的糖基化不同而类似于磷酸化修饰,它在生命过程中发挥重要的调节作用.O-GlcNAc修饰作为潜在的营养感受器,可以调节转录、代谢等众多细胞进程,并与癌症等人类重大疾病密切相关.本文主要综述了O-GlcNAc修饰与肿瘤形成和转移的关系,并对O-GlcNAc促进肿瘤形成与转移的潜在分子机制进行了探讨.

TGF-β1/Smad3信号轴的氧连糖基化修饰对小鼠心脏成纤维细胞活力和分化的影响

目的:探讨TGF-β1/Smad3信号轴的氧连糖基化修饰(O-连接的N-乙酰葡萄糖胺修饰)对体外培养的小鼠心脏成纤维细胞(MCFs)在缺氧/复氧(H/R)后活力和分化的影响及机制。方法:原代培养的MCFs缺氧6 h再恢复常氧24 h建立细胞H/R模型,通过感染O-连接的N-乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)重组腺病毒提高MCFs氧连糖基化水平,将MCFs随机分组为空载腺病毒预处理+常氧(Ad. Null+Ctrl)组、空载腺病毒预处理+H/R(Ad. Null+H/R)组、OGT腺病毒预处理+常氧(Ad. OGT+Ctrl)组和OGT腺病毒预处理+H/R(Ad. OGT+H/R)组。RT-qPCR检测结缔组织生长因子(CTGF)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18 mRNA水平;Western blot检测p-Smad3、Smad3、OGT和炎症介质蛋白水平;免疫共沉淀实验检测Smad3修饰状态及蛋白间相互结合;CCK-8法检测细胞活力;免疫荧光共聚焦显示Smad3亚细胞定位。结果:H/R致使MCFs氧连糖基化水平下降,过表达OGT显著缓解了H/R诱导的细胞氧连糖基化水平降低(P<0.05)。提高氧连糖基化水平抑制H/R诱导的MCFs活力和向肌成纤维细胞分化,减少I型胶原合成和炎症介质IL-1β/IL-18表达(P<0.05);TGF-β1信号轴胞内关键分子Smad3氧连糖基化水平升高,并且Smad3磷酸化及核转位受阻(P<0.05)。结论:氧连糖基化修饰竞争性抑制Smad3 Ser423/425磷酸化并使Smad3滞留于胞质,负向调控TGF-β1/Smad3信号轴,抑制H/R对体外培养的小鼠心脏成纤维细胞功能变化的诱导。

蛋白质O-GlcNAc修饰的检测技术

O-连接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修饰是位于细胞浆和细胞核蛋白质的丝氨酸或苏氨酸上的一种翻译后修饰,在高等真核生物细胞中广泛存在.越来越多的研究表明,O-GlcNAc修饰在代谢调控、压力应激、细胞周期、凋亡、糖尿病、心血管疾病和癌症等多种生理和病理过程中发挥重要作用,因此,O-GlcNAc修饰已受到众多生命科学领域研究人员的关注.然而,由于O-GlcNAc修饰与传统的N聚糖和O聚糖修饰有所不同,常规糖基化修饰的检测方法并不适用于O-GlcNAc.本文对O-GlcNAc修饰的检测及其修饰位点的确定方法进行了综述,并分析了各种方法的优缺点.

HBP介导的O-GlcNAc修饰在PFOS暴露致斑马鱼胚胎发育异常中的作用

目的通过构建全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate,PFOS)斑马鱼染毒模型,探讨PFOS暴露对胚胎发育的影响及可能机制。方法基于人群内暴露浓度设置PFOS暴露浓度梯度(0、0.02、0.2、2和20μmol/L),对斑马鱼胚胎染毒至120 hpf受精后小时(hourspost-fertilization,hpf),检测斑马鱼胚胎的孵化率、畸形率、死亡率、心率及运动分析等基础指标;采用非靶向代谢组学技术分析PFOS暴露后斑马鱼胚胎整体代谢水平的变化,并结合实时荧光定量(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)观察差异代谢酶及蛋白表达水平。结果暴露于20μmol/L的PFOS导致斑马鱼胚胎畸形率升高(P<0.05)、心率升高(P<0.05)、行为分析异常(P<0.05);代谢组学结果发现20μmol/L PFOS暴露组斑马鱼胚胎中葡萄糖-6-磷酸(Glu-6-P)、乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcNAc-6-P)水平显著升高(P<0.05),提示己糖胺生物合成途径(hexosamine-biosynthesis pathway,HBP)被过度激活;RT-qPCR结果显示20μmol/L PFOS组HBP关键代谢酶slc2a1b、hk1、gfat1基因表达水平显著上调(P<0.05);Western blot结果显示斑马鱼胚胎整体O-连接-N-乙酰葡萄糖胺糖基化(O-GlcNAc)水平在20μM PFOS暴露组与对照组之间存在差异。结论PFOS暴露可能通过干扰HBP途径,介导O-GlcNAc修饰水平改变导致斑马鱼胚胎发育畸形率升高及运动行为学异常,提示PFOS具有胚胎发育毒性。

EOGT介导的O-GlcNAc修饰对Notch信号通路的影响及其在疾病中的作用

O-连接-N-乙酰氨基葡萄糖(O-linked-N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)修饰是一种特殊的翻译后修饰,在众多细胞过程中发挥调节作用,例如转录、胞内信号转导、内吞作用和蛋白质稳定性。表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)结构域特异性O-GlcNAc转移酶(EGF domain-specific O-linked-N-acetylglucosamine transferase,EOGT)是一种内质网(endoplasmic reticulum,ER)驻留蛋白质,能够对含有EGF结构域的分泌或膜(跨膜)糖蛋白丝氨酸/苏氨酸残基进行糖基化修饰。Notch信号通路是一种普遍存在的细胞间通讯过程,通过邻近细胞间的相互作用调节细胞生物过程。目前,已经在多种人类疾病中发现有EOGT介导的O-GlcNAc修饰参与,并且通常与Notch信号通路相关。然而,其中具体分子机制尚未完全阐明。本文对近年来EOGT介导的O-GlcNAc修饰,以及相关Notch信号通路在多种人类疾病中的作用研究现状进行简要回顾。

O-GlcNAc修饰对调节心血管疾病的研究进展

O-糖苷键连接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修饰是在许多亚细胞结构发现的蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基的翻译后修饰方式,O-GlcNAc修饰逐渐成为许多心血管病理生理过程的关键介质。早期研究表明提高蛋白质O-GlcNAc修饰水平会导致糖尿病相关的心血管并发症,但随后发现,短期内急剧增加O-GlcNAc修饰水平却对缺血/再灌注损伤具有保护作用。蛋白质的O-GlcNAc修饰会影响细胞的许多功能,包括转录、蛋白质周转、钙处理以及生物能量学方面。蛋白质O-GlcNAc修饰对于维持正常细胞功能和体内平衡是必需的。由于应激或疾病导致的O-GlcNAc水平变化对心脏的影响是非常复杂的。

四君子汤调控肝癌癌旁组织NF-κB p65的O-GlcNAc糖基化修饰抑制肝细胞癌进展的机制

目的:探究四君子汤通过调控肝癌癌旁组织核因子-κB p65(NF-κB p65)的O-连接的β-N-乙酰葡糖胺(O-Glc NAc)糖基化修饰,干预肝癌发展的分子机制。方法:建立原位肝癌小鼠模型,将24只C57BL/6小鼠,随机分为4组,每组6只,分别为正常组、模型组、四君子汤低剂量组(10 g·kg^(-1))、四君子汤高剂量组(25 g·kg^(-1)),通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝癌癌旁组织中O-Glc NAc糖基化水平和p65的磷酸化修饰水平;免疫沉淀法(IP)检测p65的O-Glc NAc糖基化修饰水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测癌旁组织中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))、血管内皮生长因子A(VEGFA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)m RNA表达水平;观察各组小鼠肿瘤数量,称量肝脏质量;检测各组小鼠的旷场运动情况和抓力,分析小鼠的气盛衰度。结果:与正常组小鼠肝组织比较,模型组小鼠癌旁组织中O-Glc NAc糖基化水平显著下降(P<0.01);p65的O-Glc NAc糖基化修饰水平显著下降(P<0.01);p65的磷酸化水平显著升高(P<0.01);IL-6、TNF-α、TGF-β_(1)、VEGFA、MMP-2、MMP-9 m RNA水平显著升高(P<0.01);肝脏质量显著升高(P<0.01);小鼠抓力、旷场水平跨格数和垂直站立次数显著下降(P<0.01),气盛衰度显著下降(P<0.01)。与模型组小鼠比较,四君子汤低剂量组和四君子汤高剂量组小鼠癌旁组织中O-Glc NAc糖基化水平明显升高(P<0.05,P<0.01);p65的O-Glc NAc糖基化修饰水平明显上调(P<0.05,P<0.01);p65的磷酸化水平显著下降(P<0.01);四君子汤低剂量组IL-6、TGF-β_(1)、VEGFA m RNA水平明显降低(P<0.05,P<0.01);四君子汤高剂量组中IL-6、TNF-α、TGF-β_(1)、VEGFA、MMP-2、MMP-9 m RNA水平显著降低(P<0.01),直径>3 mm肿瘤数量显著减少(P<0.01),小鼠肝脏质量明显降低(P<0.05),小鼠抓力、旷场水平跨格数和垂直站立次数明显升高(P<0.05,P<0.01),气盛衰度显著升高(P<0.01)。结论:四君子汤可以抑制小鼠原位肝癌的进展,该作用可能是通过增加肝癌癌旁组织中O-Glc NAc糖基化水平,增加癌旁组织中p65的O-Glc NAc糖基化修饰,抑制p65的磷酸化修饰,最终抑制下游IL-6、TNF-α、TGF-β_(1)、VEGFA、MMP-2、MMP-9的表达而实现。

OGT在胰腺癌中表达及预后的相关研究

目的:胰腺癌(Pancreatic cancer, PC)是一种高度侵袭性的恶性肿瘤,对患者的生存率造成严重威胁。越来越多的研究表明,糖基化修饰在胰腺癌的发生和发展中扮演着关键角色。O-连接β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(O-linked N-acetylglucosamine transferase, OGT)是糖基化的关键调节者,其异常表达与多种癌症相关。本研究旨在探究OGT在胰腺癌中的异常表达,并分析其与胰腺癌预后的相关性。方法:回顾性收集2017年1月至2021年1月就诊于青岛大学附属医院确诊胰腺癌且行手术治疗患者的临床及组织病理资料。临床资料包括患者年龄、性别、身体质量指数(Body mass index, BMI)、烟酒史、糖尿病病史、家族史、肿瘤大小、位置、TNM分期、组织浸润及器官转移情况、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA)、糖类抗原19-9 (Carbohydrate antigen19-9, CA19-9)水平等信息。应用免疫组织化学染色的方法检测癌组织及癌旁胰腺导管组织中OGT的表达水平,并根据表达量的高低分为高表达组和低表达组,分析其与患者临床病理特征及预后的关系。结果:1) 胰腺癌组织中OGT的表达水平与癌旁组织的表达水平之间存在显著统计学差异(P P P > 0.05)。3) 生存分析表明,OGT的表达水平与患者不良预后存在明显相关性(P = 0.029)。结论:胰腺癌组织中OGT表达水平明显增加,OGT的高表达与淋巴结转移、TNM分期正相关。胰腺癌中OGT的高表达与胰腺癌患者不良预后相关。

OGT与AMPK相互调控的研究进展

O连接的N-乙酰葡萄糖胺修饰(O-GlcNAcylation)是一种位于细胞质和细胞核蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基上的单糖修饰。O-GlcNAcylation是由两种酶控制的高度动态可逆的修饰,分别为催化O-GlcNAcylation的O-GlcNAc转移酶(OGT)和去除O-GlcNAcylation的糖苷酶(OGA)。AMP活化蛋白激酶(AMPK)是细胞和整个生物体水平上的能量代谢稳态的主传感器和中央调节器。OGT与AMPK之间存在着相互调控关系。O-GlcNAcylation调控的蛋白参与了几乎所有的生物学过程,其修饰水平与细胞代谢状态尤其是葡萄糖浓度密切相关。本文综述了OGT活性的调节方式以及AMPK的活化方式,并进一步论述了OGT与AMPK相互调控的研究进展。

柴胡加龙骨牡蛎汤治疗围绝经期综合征的药理与临床研究进展

柴胡加龙骨牡蛎汤是载于《伤寒论》的经典名方,可和解枢机、通阳泄热、镇惊安神,与围绝经期综合征(PMS)枢机不利之病机关键相契合,临床用于治疗PMS疗效突出。其作用机制主要涉及神经内分泌系统的调节;丝裂原活化蛋白激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)、雌激素受体β(ERβ)/脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸蛋白激酶受体B(TrkB)/5-羟色胺2A受体(5-HT_(2A))、雌激素受体α(ERα)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)/γ-氨基丁酸(GABA)等相关信号通路的调控;ERα的O-连接β-N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修饰等。临床研究在调理睡眠、情绪诸症,改善神经内分泌及减轻炎症方面已有一定进展。对柴胡加龙骨牡蛎汤治疗PMS的药理及临床研究进行整理和分析总结,以期为临床应用及深入研究提供参考。

敲减OGT对肝细胞脂肪合成的作用研究

目的探讨敲减N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)对肝细胞脂肪合成的影响。方法建立L02正常肝细胞脂肪变模型,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测OGT及O-连接糖基化(O-GlcNAc)表达。建立L02细胞OGT敲减细胞系,油酸诱导后检测其脂质形成能力。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测脂肪合成相关酶的mRNA和蛋白表达。采用独立样本t检验。结果Western blot显示L02细胞脂肪变后OGT及O-GlcNAc表达均升高(P<0.05)。shOGT慢病毒感染L02细胞后,OGT mRNA相对表达水平明显下调(P<0.01)。油红O染色显示,L02 shOGT细胞内脂质减少,qRT-PCR显示系列脂肪合成酶:乙酰辅酶A羟化酶、脂肪酸合成酶和硬脂酰辅酶A去饱和酶mRNA相对表达水平均降低,差异具统计学意义(P值均<0.05),蛋白水平与mRNA相对表达量一致。结论敲减OGT后可通过降低O-GlcNAc水平抑制肝细胞脂肪合成。