O-GlcNAcase抗原片段的选择、优化表达和多克隆抗体的制备

为了探讨O-GlcNAc修饰的生物学作用和相关疾病的发病机理,需制备高效、专一的O-GlcNAcase（OGA）抗体。通过对人源OGA蛋白进行序列分析发现,氨基端1~350 aa片段（sOGA）抗原性和亲水性较强,将该片段构建至原核表达载体pET-28a,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）中进行诱导表达,通过优化IPTG浓度（0.05 mmol/L）和诱导时间（10 h）获得了高可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析和分子筛层析对重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小（45 kDa）和纯度（95%以上）。以4-MU-O-GlcNAc为荧光底物,检测到sOGA的糖苷酶活性为106 nmol/（min.mg）,表明该片段是OGA糖苷酶的活性区域。以此片段作为抗原免疫新西兰大白兔,以CNBr活化Sepharose 4B微珠纯化抗血清制备OGA特异性多克隆抗体。Western blotting和ELISA检测表明,该抗体可以特异识别含有OGA糖苷酶活性区域的多种变体,检测灵敏度为0.11 ng/mL（效价为1∶80 000）,可应用于O-GlcNAcase生物功能研究。

O-GlcNAcase抑制剂

O-连接的N-乙酰葡糖胺糖基化修饰(O-GlcNAcylation)是一种存在于蛋白质Ser/Thr上的翻译后修饰。与磷酸化相似,它参与细胞内的信号传递,并与神经退行性疾病、Ⅱ型糖尿病、癌症等许多疾病的发病机理密切相关。O-连接的N-乙酰葡糖胺水解酶(O-GlcNAcase,OGA)是生物体内唯一水解蛋白质O-GlcNAc修饰的糖苷酶。因此,研究高效、专一的OGA小分子抑制剂是调节细胞中蛋白质O-GlcNAc水平的有效策略,利于阿尔茨海默病等相关神经退行性疾病新型药物的开发。结合本实验室对OGA抑制剂的研究,本文介绍了OGA的结构、催化机理及目前OGA抑制剂的研究进展,讨论了各种抑制剂的构效关系,并对OGA抑制剂的研究前景进行了展望。

蛋白质O-GlcNAc糖基化及其细胞生物学功能

糖基化是蛋白质翻译后修饰的一项重要内容,大多数蛋白质糖基化发生在细胞膜表面,且糖链结构复杂。而发生在细胞浆与细胞核内的、单个O-GlcNAc修饰的蛋白质糖基化现象,因其独特的细胞定位、糖链连接方式以及重要的生物学调控作用而日益成为糖生物学领域研究的热点。现对蛋白质O-GlcNAc修饰及其细胞生物学功能研究进展情况进行综述。

OGA糖苷酶酶活中心的鉴定

N-乙酰葡萄糖胺(O-linkedN-acetylglucosamine,O-GlcNAc)修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰,参与生物体中的多种细胞活动.O-GlcNAcase(OGA)是生物体内唯一水解蛋白O-GlcNAc修饰的糖苷酶,但该酶的糖苷酶活性中心一直存在争论.实验利用PCR的方法,获得3种不同缺失的人源OGA片段(OGA1:aa1～916;OGA2:aa1～677;OGA3:aa1～350),并将3种片段构建到质粒pET28a中;重组质粒转化大肠杆菌BL21后,进行诱导表达、纯化;以4-甲基伞形酮2-乙酰氨基-2-脱氧葡萄糖为底物测定不同OGA片段的糖苷酶酶学特征常数.结果发现OGA3仍保持糖苷酶的活性,因此OGA的糖苷酶活性中心位于N端1-350aa.

O-GlcNAc修饰研究进展

O-GlcNAc糖基化修饰作为一种特殊的蛋白质翻译后修饰形式,动态调节细胞信号传导途径中很多酶的功能,与磷酸修饰有"阴阳调节"关系,正在成为研究的热点。本文综述了近年来O-GlcNAc糖基化修饰酶及其供体底物的研究进展。

O-GlcNAc糖基化功能研究最新进展

糖基化作为一种主要的蛋白翻译后修饰形式,在复杂的生命活动中扮演着重要角色。1984年由G.W.Hart等发现的O-GlcNAc糖基化因不同于传统的糖基化并具有重要的生物学功能,近年来引起极大的关注。O-GlcNAc糖基化的修饰机制类似于磷酸化,参与了基因转录、信号转导和细胞生长与分化等多个重要的生物学过程。此外相关研究发现,2型糖尿病、癌症及神经退行性疾病等的发生均与O-GlcNAc糖基化和磷酸化的异常相关,但是对于O-GlcNAc糖基化的功能研究目前还存在很多亟待解决的问题。就O-GlcNAc糖基化的背景、O-GlcNAc糖基化的功能研究最新进展及相关疾病的研究现状进行了简单总结,并对目前O-GlcNAc糖基化研究中所存在的重要问题进行探讨,同时,将近年来新兴的蛋白质芯片技术应用到O-GlcNAc糖基化机制及功能的研究中,或许能够为O-GlcNAc的研究提供一种新思路。