肠出血性大肠杆菌O157:H7△hly△stx△toxB基因缺失株的构建

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157:H7是食源感染的人兽共患病原菌。志贺毒素(Shiga toxin,Stx)、溶血素(haemolysin,Hly)和ToxB是O157:H7重要的毒力因子。选用自杀性质粒pMEG375,体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,借助于sm10宿主菌获得O157:H7杂交菌株,通过同源重组,依次获得O157:H7(△hly△stx△toxB)基因缺失株,△hly△stx△toxB接种HEp-2细胞和感染链霉素处理的Balb/c小鼠,明确缺失株粘附定植的能力。经PCR鉴定,hly、stx和toxB基因分别被壮观霉素(Spc+)、庆大霉素(Gm+)和卡那霉素(Kan+)基因表达盒所代替,Western blot鉴定结果显示,O157:H7(△hly△stx△toxB)检测不到相应的Stx、Hly和ToxB蛋白。O157:H7(△hly△stx△toxB)生长特性与亲本株无明显差异。对于HEp-2细胞的粘附能力明显降低。Balb/c小鼠排菌时间和排菌量明显减少和降低。本研究成功获得O157:H7(△hly△stx△toxB),并且明确Stx、Hly和ToxB的缺失导致了O157:H7对HEp-2细胞和Balb/c小鼠的粘附和定植能力降低。本研究旨在为研制EHEC O157:H7基因缺失疫苗奠定物质基础。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 toxB基因缺失株的构建

为了明确肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157∶H7大质粒pO157编码的蛋白质ToxB与O157∶H7在肠道黏附、定殖的关系,构建含有toxB基因同源臂的重组自杀性质粒pMEG375-BN-Kan-BC,转化SM10宿主菌获得重组SM10(pMEG375-BN-Kan-BC)。将SM10(pMEG375-BN-Kan-BC)与O157∶H7进行混合培养,通过同源重组,获得杂交toxB基因缺失株。用体外接种的HEp-2细胞和体内感染链霉素处理的小鼠,明确缺失株黏附定殖能力。经PCR和Western blot鉴定,toxB基因被卡那霉素(Kan+)选择标记基因表达盒所代替。O157∶H7(△toxB)生长特性与亲本株相比无明显差异。O157∶H7(△toxB)与亲本株相比,对HEp-2细胞的黏附能力降低了2倍。口服感染小鼠后,O157∶H7(△toxB)第3 d粪便排菌量仅为3.1×105 CFU,持续排菌11 d;而亲本株排菌量高达4.03×107 CFU,持续排菌时间超过14 d。

肠出血性大肠杆菌O157：H7 z1445基因缺失株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7的z1445基因,构建大肠杆菌z1445基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别经酶切后连接到p UC19-kan质粒的卡那霉素抗性基因kan两侧,PCR获得中间嵌合kan基因(带有FRT位点)的同源线性片段,利用质粒p KD46敲除z1445基因,利用质粒p CP20去除抗性标记基因;PCR鉴定及测序验证目的基因缺失后,测定缺失株及野生株的生长曲线。结果:敲除了z1445基因,突变株与野生株的生长曲线接近。结论:构建了z1445基因缺陷型菌株,为进一步分析z1445基因在O157∶H7与宿主的相互作用中发挥的作用提供了材料。

肠出血型大肠埃希菌O157:H7 ppk基因缺失株的构建及其生物学特性分析

目的利用Red重组系统构建肠出血型大肠埃希菌(EHEC)O157:H7 ppk基因缺失株,并研究其生物特性。方法设计并合成一对同源臂引物,每条引物5'端与ppk基因同源,3'端与卡那霉素抗性基因同源,扩增卡那霉素抗性基因片段;制备含有pKD46质粒的EHEC O157:H7 EDL933w感受态细菌,然后将该抗性基因片段电击转化入制备的感受态菌株中;利用pKD46介导的Red重组系统,通过同源重组替换EHEC O157:H7 EDL933w ppk基因,PCR和测序验证;通过革兰染色、测D600值、吉姆萨染色比较EHEC O157:H7 EDL933w野生株和突变株的形态结构、生长能力和黏附性。结果构建了ppk基因缺失并含有卡那霉素抗性的EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株(EHEC O157:H7 EDL933wΔppk),初步探索了EHEC O157:H7 EDL933w野生株和突变株的生物学特性。结论本研究运用Red重组系统构建了肠出血型大肠埃希菌O157:H7 ppk基因缺失株,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌中ppk基因的调控机制奠定了基础。

基于紫胶红素的靶标有色化免疫层析试纸条联检大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌

为摆脱免疫层析试纸条对配对抗体的依赖,文章设计了一种新型靶标有色化免疫层析试纸条,使用紫胶红素和十二合水硫酸铝钾媒染剂,通过先媒后染的方法,实现了免疫层析试纸条的“可视化”。验证结果显示,该试纸条对大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌的检测限均达到了106 CFU/mL;同时,与常见食源性致病菌间不存在交叉反应,在鸡胸肉、鸡蛋、牛奶等食品基质中能够在增菌9 h内检出。文章成功设计了一种操作简单、检测成本低,更易国产化的快速检测免疫层析试纸条,为后续免疫层析试纸条的设计提供了新思路。

大肠杆菌O157:H7 sRNA基因E40缺失突变株的构建

目的:利用Red系统构建肠出血性大肠杆菌O157:H7的sRNA基因E40缺失突变株。方法:选取本实验室预测并经过实验验证的sRNA基因,根据NCBI上相应的序列,设计2对引物分别扩增该sRNA基因的上下游分别长464和455bp的同源臂,经PCR扩增,构建到相应的载体,最后以构建好的含上下游同源臂和卡那霉素抗性基因的长约2500bp的线性片段作为打靶片段,在Red重组系统的作用下与sRNA基因E40的上下游同源区域发生同组,从而把sRNA基因从基因组上置换下来,之后利用质粒pCP20将FRT位点间的卡那霉素抗性基因消除。结果与结论:构建了出血性大肠杆菌O157:H7的sRNA基因E40的缺失突变株,为进一步研究sRNA基因在出血性大肠杆菌O157:H7生长及致病过程中所起的功能奠定了良好的基础。

大肠杆菌O157:H7特异基因的实时荧光定量PCR检测

为建立快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chainreaction,RT-PCR)方法,针对大肠杆菌O157:H7的特异基因rfbE设计一对特异引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行灵敏度、重复性和特异性实验,同时与常规PCR方法进行比较。结果显示所建立的SYBRGreenⅠ实时定量PCR方法可以快速、特异地检测出大肠杆菌O157:H7,细菌纯培养物中其灵敏度可达2×101CFU/mL,临床模拟污染肉样中能最低能检测到1×102CFU/mL的大肠杆菌O157:H7。与常规PCR方法相比,SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法对临床样品中大肠杆菌O157:H7的检出率大大提高。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术能快速准确、特异、敏感地检测大肠杆菌O157:H7。

我国分离的大肠埃希菌O157∶H7的毒力基因检测分析

目的了解我国部分省区分离的大肠埃希菌O157∶H7菌株特异基因和毒力基因携带特点及在不同动物宿主来源的菌株分布情况。方法采用PCR对分离菌株的O157、H7抗原特异基因rfbEO157、fliCH7以及stx1、stx2、eaeA和hlyA四种毒力基因进行检测。结果在1992-2006年收集的O157及H7抗原阳性的345株大肠埃希菌株中,rfbEO157、fliCH7特异基因均为阳性,eaeA和hlyA的阳性率分别为99.4%和99.1%,stx2的阳性率为91.9%,stx1阳性率仅为13.3%,stx1+stx2的阳性率为13.0%,来源于病人和动物菌株的stx2阳性率均高于stx1。检测菌株中毒力基因型以eaeA+hlyA+stx2为主。携带毒力基因的O157∶H7菌株在羊、牛等动物宿主中广泛存在。结论 stx2是病人及羊、牛等动物来源的产志贺毒素大肠埃希菌O157∶H7携带的主要毒素基因型。

动物源性肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR快速检测研究

目的建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌O157∶H7及其3个主要毒力基因(hylA、eaeA和stx2基因)的多重PCR方法。方法根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7菌体抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素(hlyA)基因、紧密黏附素(eaeA)基因和志贺样毒素2(stx2)基因为靶基因,设计5对特异性引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了临床样品的检测。结果该方法扩增目的基因片段分别为327bp、247bp、494bp、384bp和779bp,特异性和灵敏度均高,细菌纯培养物的检测灵敏度为104cfu/mL。结论初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR方法,可用于临床动物携带大肠杆菌O157∶H7的分子流行病学调查及食品微生物检测。

牛源大肠杆菌O157∶H7分离与鉴定及其毒力基因检测

目的研究新疆肉牛主产区健康牛群中该菌的携带情况及致病的可能性。方法对采自新疆伊犁昭苏县某牛场健康牛的85份新鲜牛粪样本,增菌后用SMAC平板和MUG实验进行筛选,再用PCR技术和生化试验鉴定;对分离到的E.coli O157∶H7用PCR法检测其Stx1、Stx2、eaeA、tccp和Hly等基因携带情况;用腹腔注射EC肉汤增菌原液的方法进行动物攻毒实验,确定分离菌株的致病性。结果 85份粪样中只鉴定出1株E.coli O157∶H7,检出率为1.176%;而这株菌同时携带被检测的5种毒力基因;攻毒实验所有的小白鼠于24h内全部死亡。结论新疆伊犁地区牛群携带有E.coli O157∶H7,从所分离到菌株所携带的毒力基因情况和对小白鼠攻毒实验结果发现,这株菌对人有很强的潜在致病性。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7鞭毛可变区基因片段的克隆、表达与免疫原性

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是食源感染的人兽共患病原菌。鞭毛蛋白(H7)是EHEC O157∶H7重要的毒力因子,其编码基因为flic。该研究在体外克隆和表达flic基因的可变区,并检测其免疫原性,旨在为EHEC O157∶H7疫苗的研制提供候选抗原。PCR扩增到flic基因538～1 483bp的可变区,成功克隆入冷诱导表达载体pColdⅠ中,构建重组表达质粒。重组菌BL21(pCold I-flic)0.5 mmol/LIPTG过夜诱导,SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。Balb/c小鼠免疫和攻毒试验评价重组H7蛋白的免疫原性。结果显示:H7基因(flic)片段945 bp在pColdⅠ中成功表达,大小为31 000,能够与天然EHEC O157∶H7全抗血清反应;免疫小鼠存活率可以达到80%,而非免疫小鼠存活率仅为20%;免疫组粪便排菌数量显著低于对照组(P<0.05)。以上结果说明,H7鞭毛的可变区与菌体黏附密切相关,并且其诱导产生的抗体具有一定的抑制黏附作用,可以作为亚单位疫苗研制的候选抗原,在EHEC O157∶H7早期黏附时,协同Ⅲ型分泌系统蛋白降低菌体在肠道内的黏附。

鉴定大肠杆菌O157:H7特异基因的PCR方法

目的建立一种特异、灵敏鉴定大肠杆菌O157:H7的PCR检测方法。方法针对大肠杆菌O157:H7表面抗原O和鞭毛抗原H的特异性基因rfbO157、fliCH7设计引物,分别扩增出目的产物。结果利用建立的方法对4株大肠杆菌O157:H7菌及12株非大肠杆菌O157进行检测,rfbO157、fliCH7基因的特异性均为100%;rfbO157基因的灵敏度约为6×104cfu/ml;fliCH7基因的灵敏度可达6cfu/ml。结论本方法特异性好,为实验室鉴定大肠杆菌O157:H7提供了一种简单、容易操作的手段。

牛源性Escherichia coli O157:H7分离鉴定、耐药性及耐药基因分析

了解某牛场犊牛群发腹泻后继发胸膜炎、腹膜炎并造成犊牛大量死亡的主要病原菌及其耐药性情况。采集病死犊牛肺、腹膜和肠系膜等脏器,进行病原菌分离、鉴定,并对分离的主要致病菌株进行药敏试验及耐药基因检测。结果表明,引起此次犊牛腹泻及胸膜炎、腹膜炎的主要致病菌为E.coli O157:H7;药敏试验结果表明分离菌对青霉素、四环素和氨苄西林等12种抗生素耐药,对头孢哌酮、头孢他啶、丁胺卡那等8种抗生素敏感,表现为多重耐药。该分离菌同时携带tet B、str B、aad B、aph A、flo R和TEM等耐药基因,耐药基因型和耐药表型不完全相同。研究可为E.coli O157:H7的防治和耐药性控制提供依据。

新疆牛源大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定及ERIC-PCR基因分型研究

为了了解牛源大肠杆菌(E.coli)O157∶H7在新疆地区的污染状况以及遗传多样性,探究不同地区分离菌株的遗传关系,为控制牛源E.coli O157∶H7的传播提供试验依据。将采集的样品在EC肉汤中进行增菌(37℃、180 r/min),接着将增菌液划线接种到SMAC平板上,37℃培养箱中过夜培养18 h左右。挑取SMAC平板上白色或无色单菌落接种MUG培养基,37℃培养18 h左右,将无荧光样品接种到SMAC平板上,37℃培养18 h左右,隔天挑取白色或无色单菌落进行PCR鉴定,具有rfbE和fliC基因条带的即为阳性菌株。将阳性菌株进行肠杆菌基因间重复共有序列扩增(ERIC-PCR)指纹图谱聚类分析,分析菌株之间的同源性关系。ERIC-PCR结果显示,相似性100%的菌株有3组。从伊犁地区分离到的菌株差异性最大,具有6种分型;其次是乌鲁木齐,具有4种分型。菌株来源多样性最多的在D簇,由此可见通过ERIC-PCR分型,可以进行溯源观察。ERIC-PCR能够区分特定采样点或物种的分离物,它能够证明从不同来源的菌株之间,存在着某些相似的ERIC特性,并聚集在同一个簇群中。该研究中筛选出的E.coli O157∶H7菌株具有广泛的遗传多样性,该方法对于检测不同物种间的细菌差异非常敏感。由此可见ERIC-PCR可以作为E.coli O157∶H7常规监测和鉴定的一个有效的工具。

大肠埃希菌O157∶H7特异基因检测与毒力基因分析

目的 :对江苏省 2 0 0 0和 2 0 0 1年分离的经血清玻片凝集试验初筛为大肠埃希菌O15 7∶H7(E .coliO15 7∶H7)的菌株进行O15 7O抗原及H 7抗原特异性基因检测 ,了解 2 0 0 0年监测点宿主动物分离O15 7菌株毒力基因携带率及毒力基因图谱。方法 :用聚合酶链反应法检测O15 7特异基因、H 7特异基因 ,多重引物聚合酶链反应法检测VT1、VT2、eaeA、hly等毒力基因并进行分析。结果 :13 4株血清玻片凝集试验初筛为E .coliO15 7∶H7的菌株经特异基因检测确定为E .coliO15 7的占 72 .4% (97 13 4) ,E .coliO15 7∶H 7的仅为 2 9.1% (3 9 13 4) ;非O15 7菌株占 2 6.9% (3 6 13 4) ,有44 .3 % (5 8 13 4)的O15 7菌株鞭毛抗原不是H7。 2 0 0 0年宿主动物分离菌株 ,经特异基因检测为非O15 7的不携带毒力基因 (0 18) ;为E .coliO15 7∶H ?的菌株 ,毒力基因携带率为 10 .7% (3 2 8) ;确定为E .coliO15 7∶H 7的菌株 ,毒力基因携带率高达 93 .1% (2 7 2 9) ,且毒力基因型以VT2 +eaeA +hly为主。 结论 :特异性基因检测鉴定E .coliO15 7∶H7,可大大减少血清玻片凝集试验的误判 ,结合毒力基因检测 ,可分析E .coliO15 7∶H 7菌株毒力基因型的变化 ,对制定切实有效的防制对策控制E .coliO15

免疫磁珠法分离大肠杆菌O_(157):H_7及毒力基因的PCR检测

为了了解新疆不同牛场中大肠杆菌O157:H7的流行情况,对新疆乌鲁木齐、伊犁地区、塔城地区多个牛场采集的粪样及水样样本的检测,样品经EC肉汤增菌、免疫磁珠富集后,用SMAC平板和MUG培养基进行初步筛选,再用rfb E和fli C基因对筛选后的疑似大肠杆菌O157:H7菌株做PCR检测,同时结合生化试验的方法进行符合性检验。结果从新疆3个地区不同牛场的208份样品分离得到5株肠出血性大肠杆菌O157:H7,检出率为2.4%。其中粪样检出5株,检出率为2.4%;水样未检出。生化试验结果表明,5株分离出的大肠杆菌O157:H7菌株与国标规定的O157:H7特性相同。表明,部分被检牛场存在大肠杆菌O157:H7威胁,应该引起重视。

安徽省114株EHECO_(157)∶H_7菌株毒力因子基因的初步分析

目的 对安徽省近几年分离的肠出血性大肠杆菌O1 57∶H7(EHECO1 57∶H7)菌株的毒力因子基因进行实验室检测 ,以分析和研究肠出血性大肠杆菌O1 57∶H7的毒力特征和致病特性。方法 采用聚合酶链反应(PCR)检测EHECO1 57∶H7的两种重要的毒力因子志贺样毒素 (SLT)和溶血素 (hly)的特异性基因片段 ,并辅以血清学试验、生化试验进行菌株的生物学特性鉴定。结果和结论 检测结果显示 ,有 6 3 2 %的EHECO1 57∶H7菌株携带SLT、hly基因 ,动物源的菌株以家禽较高 ,家畜次之 ,3株源自腹泻病人的菌株毒力因子基因携带率为33 3% ,说明分离的EHECO1 57∶H7菌株具有较强的致病性 ;114株菌株中 ,有 14 0 %的菌株在 2 4h内发酵山梨醇 ,发酵山梨醇菌株的毒力因子基因携带率 18 8% ,显著低于不发酵菌株的 70 4 % 。

大肠杆菌O157:H7VT2毒素基因的克隆及测序

目的 克隆出血性大肠杆菌O15 7:H7的VT2毒素基因。方法 利用PCR技术从出血性大肠杆菌O15 7:H7染色体基因组中扩增出VT2毒素基因 ,并连接至pGEM -T载体上 ,构建重组质粒pGVT2并进行序列测定。结果与结论 酶切分析表明重组质粒含有VT2毒素基因 ,核苷酸序列分析表明 ,其序列与GenBank上O15

遗传标志性基因Z0372 PCR检测肠出血大肠杆菌O157:H7

肠出血性大肠杆菌（Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC）O157：H7是重要的食源性病原菌,导致严重的人兽共患病。本文旨在建立以Z0372基因为靶基因的PCR检测技术,特异性检测EHEC O157：H7。以Z0372基因为靶序列,设计引物,建立Z0372-PCR,分析敏感性、特异性,并检测模拟阳性污染样品。结果表明,Z0372-PCR对纯培养物检测限103~104CFU/m L,模拟阳性污水样和肉样,增菌后检测限10~102CFU/m L（g）。非大肠杆菌O157和其他肠道病原全部为阴性扩增,只有肠出血性大肠杆菌O157：H7扩增出清晰而特异的条带。模拟阳性样品检测,条带特异,无任何杂带,测序与Gen Bank序列高度同源。因此,Z0372-PCR是特异性检测肠出血性大肠杆菌O157：H7的技术,操作简便,成本低廉,适合实验室肠道内容物、刮取物、污水和食品等的快速检测。