病原菌多糖基因簇在大肠杆菌中的克隆

目的：构建稳定的外源病原菌多糖基因簇克隆载体，为在糖基工程大肠杆菌中利用外源性多糖O-糖基化修饰靶标蛋白奠定基础。方法：PCR扩增大肠杆菌O157、甲型副伤寒沙门菌CMCC50973和铜绿假单胞杆菌CMCC10110的O-多糖合成基因簇，将多糖基因簇与细菌人工染色体pCC1BAC连接后，分别转化O-多糖合成缺陷的大肠杆菌W3110，并用相应多糖抗血清ELISA检测重组大肠杆菌是否利用外源O-多糖生成脂多糖（LPS），从而验证外源多糖基因簇克隆载体在大肠杆菌内是否能够生成相应的O-多糖；在此基础上，将构建的3种外源多糖基因簇克隆载体分别转化表达O-寡糖转移酶和蛋白底物菌毛蛋白PilE的糖基工程大肠杆菌，用相应的抗血清进行Western印迹检测，以验证克隆的O-多糖能否修饰蛋白底物PilE。结果：与阴性对照菌相比，带有大肠杆菌O157的O-多糖合成基因簇克隆载体和带有甲型副伤寒沙门菌CMCC50973的O-多糖合成基因簇克隆载体的重组菌ELISA呈阳性，提示大肠杆菌O157和甲型副伤寒沙门菌CMCC50973的O-多糖合成基因簇在大肠杆菌中被利用生成了相应的LPS；而带有铜绿假单胞杆菌CMCC10110的O-多糖合成基因簇克隆载体的重组菌W3110/BAC-10110则ELISA呈阴性。West？ern印迹结果显示，只有带有O157型大肠杆菌O-多糖合成基因簇克隆载体的糖基工程大肠杆菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL/BAC-O157在相对分子质量40×103~58×103处出现了特异条带，表明菌毛蛋白PilE被大肠杆菌O157型O-多糖O-糖基化修饰。结论：建立了大肠杆菌O157、甲型副伤寒沙门菌CMCC50973的O-多糖合成基因簇大片段的克隆载体，克隆的O157型O-多糖合成基因簇可实现O157型多糖对菌毛蛋白PilE的修饰，从而为在大肠杆菌中建立稳定的利用外源病原菌多糖修饰靶标蛋白的糖基工程大肠杆菌提供了技术基础。

用大肠杆菌制备O157多糖-菌毛蛋白结合物的研究

目的以大肠杆菌O157型多糖与菌毛蛋白PilE为模型,在大肠杆菌中重构脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修饰系统,为建立一步生物交联法制备多糖-蛋白结合疫苗技术提供基础。方法用Red重组技术敲除大肠杆菌W3110的O抗原连接酶基因waaL,构建CLM24菌株。在该菌株中共表达脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白基因pilE、寡糖转移酶基因pglL,构建O-糖基化修饰系统。分别转化大肠杆菌鼠李糖转移酶基因wbbL与大肠杆菌O157型多糖表达载体于构建了O-糖基化修饰系统的大肠杆菌,再利用Western印迹检测菌毛蛋白PilE的修饰情况。结果利用抗His-tag单抗进行Western印迹检测,16℃IPTG诱导条件下,转化大肠杆菌鼠李糖转移酶基因wbbL于构建了O-糖基化修饰系统的大肠杆菌,重组菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-wbbL-pglL与其他对照菌相比,不仅在相对分子质量为19×103处有特异性条带,而且在相对分子质量(40～60)×103处也出现了特异的梯状条带;转化大肠杆菌O157的O多糖基因簇克隆载体于构建了O-糖基化修饰系统的大肠杆菌,重组菌CLM24/pMMB66EHpilE-his/pETtac28-pglL/pACYC184-O157用抗O157多抗和抗His-tag单抗进行Western印迹检测,在相对分子质量(40～60)×103处均产生特异的梯状条带。结论在大肠杆菌中重建的O-糖基化修饰系统可以利用自身的O16型O多糖或异源的O157型O多糖修饰菌毛蛋白PilE,获得多糖-蛋白结合物。本研究为建立一步生物交联法制备多糖-蛋白结合疫苗提供了技术基础。