大肠杆菌O157菌株的噬菌体分型研究

目的 探讨O157菌株噬菌体分型在细菌分型诊断中的应用。方法 应用6株大肠杆菌分型噬菌体对30株O157菌株进行噬菌体裂解实验,通过其裂解模式进行噬菌体分型。结果 菌株进行亚分型时噬菌体分型能较好地体现出菌株的地域特征,同一fliC型别的菌株,可以具有不同的噬菌体裂解模式,不同fliC型别的菌株,可以具有相同的噬菌体裂解模式。结论 fliC型别与噬菌体分型可以互相补充。为流行病学调查和疫情控制提供有力的病原学证据。

东台市肠出血性大肠埃希菌O157感染监测

目的 为掌握肠出血性大肠埃希菌O15 7在东台市家禽、家畜中的带菌,腹泻病人中的感染和自来水厂水源水中的污染情况。方法 2 0 0 0 -2 0 0 2年,分别在流行季节采集家禽、家畜和腹泻病人粪便及自来水厂水源水,应用免疫磁珠浓集、山梨醇麦康凯平板分离、生化和血清学反应进行鉴定。结果 3年间东台市采集的6种动物粪便有4种中检出肠出血性大肠埃希菌O15 7,其阳性率牛为11 .3 2 %、羊为10 . 5 8%、猪为9. 3 5 %、鸡为7 .73 %。腹泻病人的阳性率为1 .5 7%。采集的178份自来水厂水源水、60只苍蝇标本中均未分离出肠出血性大肠埃希菌O15 7。3株自动物粪便分离株具有至少2种混合型毒力基因。75株肠出血性大肠埃希菌O15 7菌株对15种抗生素存在不同的耐药率。结论 东台市家禽、家畜和腹泻病人中存在肠出血性大肠埃希菌O15 7感染,且存在流行的潜在危险。

辽宁地区猪源大肠埃希菌O157:H7的流行病学调查和耐药性分析

猪源大肠埃希菌O157:H7是一种新型的人畜共患致病性大肠埃希菌[1],可通过污染的牛肉、奶制品、蔬菜、水果等途径感染人类或畜禽。不仅严重危害生猪养殖业的发展,而且对人类的健康也构成巨大威胁,人感染后主要表现为腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合征、血栓性血小板减少性紫癜等症状。众多动物食品污染源中,猪是其最重要宿主之一。本文从辽宁省9个地区的无害化处理厂、生猪养殖场和生猪屠宰场采集猪肛门拭子900份,进行大肠埃希菌O157:H7分离鉴定以及耐药性分析,为了解辽宁地区猪大肠埃希菌O157:H7的感染情况提供基础数据。

不同方法检测食品中大肠埃希氏菌O157:H7/HM能力验证结果比较与分析

为提高实验室对食品中大肠埃希氏菌O157∶H7的检验检测能力,笔者单位参加了由中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的食品中大肠埃希氏菌O157∶H7检测能力验证计划。此次实验采用国家标准《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157∶H7/NM检验》(GB 4789.36—2016)中的第一法和实时荧光PCR方法,分别对能力验证样品进行检测。结果显示,样品23-G520中未检出大肠埃希氏菌O157∶H7;样品23-F568中检出大肠埃希氏菌O157∶H7,结果反馈为满意。在能力验证实验中,不同检测方法同时使用、综合判断,能有效提高检测能力和结果的准确性。

我国分离的大肠埃希菌O157∶H7的毒力基因检测分析

目的了解我国部分省区分离的大肠埃希菌O157∶H7菌株特异基因和毒力基因携带特点及在不同动物宿主来源的菌株分布情况。方法采用PCR对分离菌株的O157、H7抗原特异基因rfbEO157、fliCH7以及stx1、stx2、eaeA和hlyA四种毒力基因进行检测。结果在1992-2006年收集的O157及H7抗原阳性的345株大肠埃希菌株中,rfbEO157、fliCH7特异基因均为阳性,eaeA和hlyA的阳性率分别为99.4%和99.1%,stx2的阳性率为91.9%,stx1阳性率仅为13.3%,stx1+stx2的阳性率为13.0%,来源于病人和动物菌株的stx2阳性率均高于stx1。检测菌株中毒力基因型以eaeA+hlyA+stx2为主。携带毒力基因的O157∶H7菌株在羊、牛等动物宿主中广泛存在。结论 stx2是病人及羊、牛等动物来源的产志贺毒素大肠埃希菌O157∶H7携带的主要毒素基因型。

广西肠出血性大肠埃希菌O157监测研究

目的了解广西人和动物中EHECO157的流行强度与规律,为卫生决策提供依据。方法采集腹泻病人和家禽家畜粪便、苍蝇及生熟肉类食品标本,经mEC肉汤增菌、O157快诊金卡筛选和免疫磁珠富集后,接种CHROMagarO157显色培养基,最后进行生化和血清学鉴定。结果2007-2008年,广西共采集各类标本3964份,从牛粪、猪粪、鸡粪和苍蝇标本中检出O157菌株22株,检出率分别为4.35%、1.27%、0.70%和1.84%,其它标本均未检出。22株O157菌株中有18株O157∶H7、4株O157:H-,分布于4-11月。结论广西家禽家畜和苍蝇均有较高的EHECO157带菌率,存在人感染甚至发生人间暴发流行的危险,应继续加强监测并采取适当措施以降低家禽家畜带菌率。

基于内参的大肠埃希氏菌O157∶H7实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

针对大肠埃希氏菌O157∶H7 rfb E和Flic靶基因保守序列,设计特异性引物和探针,优化反应体系,并加入内参(internal amplification control,IAC),建立能够实时监控反应过程的荧光定量聚合酶链式反应(polymease chain reaction,PCR)检测方法。结果表明,该方法对E.coli O157∶H7基因组DNA的最低检测限为1 pg/μL;对含有靶基因质粒的最低检测限为103 copies/μL;对细菌的最低检测限为5×103 CFM/m L;Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(R2=0.999)。人工污染实验结果表明,在初始菌量为7 CFM/25 g时,采用水洗加试剂盒法提取DNA,E.coli O157∶H7在增菌6 h后即可检出;而采用水煮法提取DNA,则在增菌10 h后方可检出。建立的E.coli O157∶H7实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中O157∶H7,又能实时监测PCR反应过程,有效防止"假阴性"的发生。

应用免疫磁珠分离法及荧光定量PCR技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7

目的建立免疫磁珠分离法(immunomagnetic separation,IMS)联合荧光定量PCR(real-time PCR)技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法。方法根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfbEO157设计引物和荧光探针,建立real-time PCR检测体系,并检测其特异性及敏感性;用O157免疫磁珠特异性捕获标本菌液中的O157∶H7大肠埃希菌,结合real-time PCR对磁珠捕获菌细胞的DNA进行检测分析。结果 Real-time PCR检测结果显示,O157∶H7大肠埃希菌可产生荧光信号,而其他常见致病菌均未见明显荧光信号;采用IMS-real-time PCR方法检测标本,菌液含菌量为3.3×102CFU/mL时即可被检出,检测全过程需时约4h。结论 IMS-real-time PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、快速易操作等特点,该检测方法能提高O157∶H7大肠埃希菌的检出率和准确性,可用于标本的快速诊断、疾病监测和暴发疫情的病原学调查。

上海市动物及其产品中大肠埃希菌O157:H7带菌情况的调查

为了解上海市动物及动物产品中大肠埃希菌O 157∶H 7带菌情况及其毒力采集上海市猪、牛等动物粪便以及市场和超市猪肉、牛肉、牛奶、虾仁等样本568 份,应用免疫胶体金技术、分离培养、形态特征观察生化特性鉴定、血清学试验、多重引物PCR进行大肠埃希菌O 157∶H 7的分离、鉴定及毒力基因分析。结果表明,上海市动物及动物产品中存在大肠埃希菌O 157∶H 7,检出率为2.05%。其中牛粪、猪粪中检出率较高,分别为9.76%和8.57%。

阀控多通道微流控芯片高通量快速检测大肠埃希菌O_(157):H_7

目的建立一种基于气阀控制的多通道微流控芯片系统,实现高通量、低成本、快速检测大肠埃希菌O157:H7。方法采用集成多条反应通道和控制气阀的微流控芯片,用气阀控制芯片通道内反应的顺序,在通道交叉处构建出10个检测区。然后以免疫荧光技术为检测手段,检测水和粪便标本中的大肠埃希菌O157:H7。结果成功建立了一种基于气阀控制的多通道微流控芯片系统,并应用于大肠埃希菌O157:H7的快速检测。此芯片一次可同时检测10个样本,单个样本检测时间少于10min、试剂消耗量仅为0.5μL,对大肠埃希菌O157:H7的最低检测限为1×103CFU/mL。检测大肠埃希菌O157:H7组的荧光信号(4 122±164)与大肠埃希菌ATCC 25922(2.67±0.45)及伤寒沙门菌(3.33±0.94)比较,差异有统计学意义(t分别为35.78和30.79,P均<0.01)。批内精密度为5.2%。将本法用于模拟临床样品中大肠埃希菌O157:H7的测定,敏感性和特异性分别为62%和100%,与培养法的总体符合率为81%。结论基于气阀控制的多通道微流控芯片系统可实现高通量、低成本、快速检测大肠埃希菌O157:H7,有望成为一种高效和快捷的新检测方法。

多重PCR检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7

目的建立一种快速、特异的检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7菌株的多重PCR方法。方法针对O157:H7菌株的O157、H7抗原特异基因rfbEO157、fliCH7以及stx1、stx2、eaeA和hlyA四种毒力基因设计相应引物,在同一扩增体系中进行PCR反应,通过优化多重PCR反应条件和循环参数,建立检测O157:H7菌株的多重PCR方法,并测定其特异性和灵敏度。结果 6对特异性引物各自扩增相应的基因片段,检测结果与常规PCR获得的结果一致。细菌纯培养物的检测灵敏度为1.33×104CFU。结论该多重PCR方法能在一次检测中同时反映待测菌株是否为肠出血性大肠埃希菌O157:H7及其携带毒力基因的情况,可为O157:H7大肠埃希菌感染的诊断及流行病学调查提供一种简便、快速的检测手段。

大肠埃希氏菌O157:H7的HDA检测方法的建立

采用自行建立和优化的依赖解旋酶DNA恒温扩增(HDA)检测体系,建立HDA检测方法对大肠埃希氏菌O157:H7进行检测。采用大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测大肠埃希氏菌O157:H7的HDA检测法,进行了特异性和灵敏度试验,并与普通PCR方法进行了比较。结果表明:所建立起的检测法,灵敏度为4.3×103 cfu·mL-1,灵敏度与普通PCR方法相当。大肠埃希氏菌O157:H7的依赖解旋酶DNA恒温扩增检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,用普通水浴槽即可进行反应。具有广阔的推广前景。

食品中肠出血性大肠埃希菌O_(157):H_7的PCR检测

目的建立快速准确检测食品中肠出血性大肠埃希菌O157:H7的方法。方法采用多重聚合酶链式反应技术(MPCR)特异性扩增肠出血性大肠埃希菌O157:H7的STX、rfbEf、liC基因。结果分别在228,378,709 bp处扩增出3个目的基因片段,且只有肠出血性大肠埃希菌O157:H7获得扩增,其他菌种扩增均呈阴性。结论PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便,为食品中肠出血性大肠埃希菌O157:H7的快速检测提供了新的手段。

检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7的环介导等温扩增和PCR法比较

目的建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7快速简便检测方法,并与PCR进行比较。方法针对EHEC O157:H7保守的rfbE基因序列,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术并优化其反应条件,比较这两种检测方法的灵敏度、特异性和对实际样品的检测结果。结果成功建立了LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限低至10 cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对39株近源菌进行检测,结果显示,LAMP法仅7株EHEC O157:H7得到阳性结果,非EHEC O157:H7菌株均为阴性,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP法特异性比PCR法高。对于32份猪肉样品的检测,LAMP和PCR与常规检测结果一致,3份样品检测阳性。结论 LAMP检测技术的特异性和灵敏度较PCR高,并且操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速准确检测EHEC O157:H7的有效手段。

TaqMan探针荧光PCR检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7方法的建立

肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagie Escherichia coli,EHEC)O157:H7是一种重要的传染病病原菌,以EHEC O157:H7标准菌株rfbE保守区设计一对特异引物和一条探针,建立了检测EHEC O157:H7核酸的荧光定量PCR检测方法。实验结果表明荧光定量PCR检测方法特异性好,最低检测限为20 cfu/mL,线性范围是102～108cfu/mL。稳定性试验表明批内变异系数和批间变异系数分别为2.06%和2.45%。

江苏省肠出血性大肠埃希菌O157的基因PCR-RFLP分型研究

目的对历年从江苏省不同地区分离的肠出血性大肠埃希菌O157(以下简称:O157)进行分型分析。方法采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法对108株O157分子分型,比较不同地区、不同年份菌型差异。结果根据EcoRV限制性酶切图谱可将菌株分成JS01-JS10十个不同的型别。主要菌型JS01占64.9%,JS02型与JS01型菌株酶切图谱相似度很高,JS03和JS04型菌株数目较少(12株),但近一半属于人源菌株。从时间方面看,1999年分离的菌型最多;从地区方面看,铜山县分离到的菌株型别最为多样化。结论不同菌型之间的致病性存在差异,菌株与地理来源的关系密切。PCR-RFLP方法操作简便、重复性好,为O157的流行病学研究提供了一条全新途径。

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7黏附HeLa细胞模型的建立

目的建立肠出血性大肠埃希菌O157∶H7体外黏附HeLa细胞模型,为进一步研究其致病机制奠定基础。方法以细菌黏附HeLa细胞数量为指标,分别评价细菌数量、细菌与细胞孵育时间对细菌黏附数量的影响,得到最佳条件,最后肌动蛋白荧光染色(FAS)试验鉴定模型。结果加入细菌为1×105CFU,细菌与细胞孵育4h时,黏附细胞的数量最佳,FAS检测发现该条件下细菌能够引起细胞特异性黏附、擦拭(attaching&effacing,A/E)损伤,模型建立成功。结论成功建立O157∶H7体外黏附HeLa细胞模型,为进一步研究其致病机制提供了条件。

大肠埃希菌O157∶H7特异基因检测与毒力基因分析

目的 :对江苏省 2 0 0 0和 2 0 0 1年分离的经血清玻片凝集试验初筛为大肠埃希菌O15 7∶H7(E .coliO15 7∶H7)的菌株进行O15 7O抗原及H 7抗原特异性基因检测 ,了解 2 0 0 0年监测点宿主动物分离O15 7菌株毒力基因携带率及毒力基因图谱。方法 :用聚合酶链反应法检测O15 7特异基因、H 7特异基因 ,多重引物聚合酶链反应法检测VT1、VT2、eaeA、hly等毒力基因并进行分析。结果 :13 4株血清玻片凝集试验初筛为E .coliO15 7∶H7的菌株经特异基因检测确定为E .coliO15 7的占 72 .4% (97 13 4) ,E .coliO15 7∶H 7的仅为 2 9.1% (3 9 13 4) ;非O15 7菌株占 2 6.9% (3 6 13 4) ,有44 .3 % (5 8 13 4)的O15 7菌株鞭毛抗原不是H7。 2 0 0 0年宿主动物分离菌株 ,经特异基因检测为非O15 7的不携带毒力基因 (0 18) ;为E .coliO15 7∶H ?的菌株 ,毒力基因携带率为 10 .7% (3 2 8) ;确定为E .coliO15 7∶H 7的菌株 ,毒力基因携带率高达 93 .1% (2 7 2 9) ,且毒力基因型以VT2 +eaeA +hly为主。 结论 :特异性基因检测鉴定E .coliO15 7∶H7,可大大减少血清玻片凝集试验的误判 ,结合毒力基因检测 ,可分析E .coliO15 7∶H 7菌株毒力基因型的变化 ,对制定切实有效的防制对策控制E .coliO15