基于紫胶红素的靶标有色化免疫层析试纸条联检大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌

为摆脱免疫层析试纸条对配对抗体的依赖,文章设计了一种新型靶标有色化免疫层析试纸条,使用紫胶红素和十二合水硫酸铝钾媒染剂,通过先媒后染的方法,实现了免疫层析试纸条的“可视化”。验证结果显示,该试纸条对大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌的检测限均达到了106 CFU/mL;同时,与常见食源性致病菌间不存在交叉反应,在鸡胸肉、鸡蛋、牛奶等食品基质中能够在增菌9 h内检出。文章成功设计了一种操作简单、检测成本低,更易国产化的快速检测免疫层析试纸条,为后续免疫层析试纸条的设计提供了新思路。

食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的检测技术研究进展

近年来,因食源性致病菌造成的食品中毒正在不断增加,严重威胁了人类的健康,大肠杆菌(E.coli)O157∶H7由于其低感染剂量和高致病性等特点引起了研究人员和世界卫生组织的高度重视。因此精准快速的检测食品中的E.coli O157∶H7对食品安全问题有着重要的意义,是预防和控制食源性疾病传播的重要技术,为此本文对E.coli O157∶H7的常规检测方法、免疫学法、分子生物学法和其他方法进行论述,介绍了这些方法的优缺点,对各种方法进行了整体比较,以期为有关工作者在选择检测方法或研发新方法提供参考。

大肠杆菌O157:H7烈性噬菌体SF08的分离、表征及在食品中的应用

本研究通过双层平板法从湖水中分离、纯化出一株大肠杆菌O157:H7烈性噬菌体,并命名为SF08。对其生物学特性、基因组序列及在即食鸡爪中的抑菌效果进行分析。结果表明,SF08由长约124 nm的可收缩尾巴和直径约76 nm的多面体头部组成。最佳感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)为0.01;潜伏期为20 min,裂解期为20~110 min,爆发量为66 PFU/cell;在pH 3~12和30~70℃条件下能保持较高的活性。基因组全长59704 bp,G+C含量为56.52%,共有72个开放阅读框(ORF)。SF08在4℃下可以极显著地抑制即食鸡爪中模拟污染的大肠杆菌O157:H7(P<0.01)。本研究表明SF08具有较好的生物学特性及安全性,为后续研发和制备天然杀菌剂提供理论基础和参考。

一种可快速检测大肠杆菌O157:H7的纸基传感器的制备与应用

大肠杆菌O157:H7是一种致病性较强的食源性细菌,通常在生制食品中被检出,一旦被人体摄入会引发肠道疾病,严重危害公众健康。本研究制备了功能化的长余辉探针,并结合适配体的特异性识别功能构建了能快速检测大肠杆菌O157:H7的纸基传感器,检出限达7.5×10^(3) CFU·mL^(-1)。该传感器可同时检测3个样品,具有特异性好、操作简便和环境友好的特点,可应用于大量样品中大肠杆菌O157:H7的快速筛查。

纳米金与纳米金花标记的免疫层析法的建立及快速检测大肠杆菌O157∶H7的比较研究

为实现大肠杆菌O157∶H7早期现场的快速检测,该试验通过化学还原法与介导生长法制备了AuNPs与AuNFs作为标记探针,建立2种用于大肠杆菌O157∶H7现场快速检测的免疫层析试纸条,并对2种试纸条的的灵敏度、特异性和准确性进行检测。结果显示,所建立的2种免疫层析方法均可在15 min内检出食品中的大肠杆菌O157∶H7,其中AuNP试纸条最低检出限为3.2×10^(5)CFU/mL,AuNFs试纸条最低检出限为3.2×10^(4)CFU/mL,与单增李斯特菌、沙门氏菌、坂崎肠杆菌等常见食源性致病菌没有交叉反应。对人工污染果冻、牛奶和牛肉等样品AuNPs试纸条分别在前增菌5、6、5 h时检出,AuNFs试纸条分别在前增菌5、5、4 h时检出,且不受食品复杂机制的影响。结果表明,所建立的2种免疫层析试纸条灵敏度高、特异性强、操作简便,适用于大肠杆菌O157∶H7现场快速检测。

基于dsDNA-CuNCs的荧光ELISA检测牛奶中的E.coli O157:H7

目的:建立了一种灵敏检测牛奶中大肠杆菌O157:H7的新型荧光酶联免疫吸附方法。方法:以碱性磷酸酶水解焦磷酸盐-Cu^(2+)配位复合物,释放出Cu^(2+)形成铜纳米簇作为信号报告探针,通过对关键因素Cu^(2+)浓度、焦磷酸盐浓度、DNA模板的浓度和长度进行优化。结果:在最优条件下,大肠杆菌O157:H7的菌数为5×10^(4)~1×10^(8)CFU/mL时,与荧光信号值有较好的线性关系(R^(2)=0.9808),最低检出限为2.4×10^(4)CFU/mL。结论:该方法成功地应用于低脂牛奶和脱脂牛奶样本中大肠杆菌O157:H7的测定,平均回收率为92.2%~10^(8).5%,相对标准偏差为4.9%~10.4%。

基于抗体-适配体夹心生物传感器检测大肠杆菌O157:H7

大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是一种重要的与公共卫生相关的食源性病原体。抗体分子是体液免疫应答中最重要的效应分子,具有多种生物学活性,最主要的生物学功能是与相应抗原特异性结合。适配体是体外合成的较短DNA序列,可通过识别特定区域和靶标特异性结合。利用抗体和适配体的特异性识别功能及免疫磁珠的捕获作用和磁分离,并通过多克隆抗体和裁剪得到的适配体搭建生物传感器,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)可以实现对靶标在(8×10^(3))-(8×10^(6))CFU/mL范围内的定量检测,检测限为800 CFU/mL。

致病菌快速检测管联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法鉴定即食食品中的大肠埃希氏菌O157:H

目的建立基于致病菌快速检测管技术联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)快速、高效、准确鉴定即时食品中大肠埃希氏菌(Escherichia coli,E.coli)O157:H7的方法。方法选取改良胰蛋白胨大豆肉汤(modified tryptone soya broth,mTSB)为初筛培养基,制作出针对即时食品中E.coli O157:H7的致病菌快速检测管,初筛阳性结果采用MALDI-TOF MS技术鉴定。结果5株常见E.coli O157:H7菌株均能特异检出,而其他非E.coli O157:H7均未检出,灵敏度可达51 CFU/mL;通过对人工污染样品和自然样品检测,鉴定结果和GB 4789.36—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》方法完全一致,且检测效率提高了30%。结论两种技术联合应用建立的鉴定即时食品中E.coli O157:H7的新方法,操作简便、成本低廉,适合推广,为快速、准确鉴定即时食品中E.coli O157:H7打开了新思路。

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测食源性大肠埃希氏菌O157:H

目的 建立一种快速、灵敏、特异、高效的食源性大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法 针对大肠埃希氏菌O157:H7型的O抗原特异基因rfbE保守区域设计特异性引物和探针,合成基因片段绘制标准曲线,在菌液基因组DNA和质粒双层面调试优化以完成方法的初步建立。其后,对该方法的特异性、敏感性、重复性等进行全面的质量评估验证。结果 该方法特异性100%;基因组DNA检测敏感性为7.11×10^(2)fg/μL;纯培养物水平检测敏感性为1.0×10^(2)CFU/mL;重复性变异系数在0.10%~1.00%之间;标准曲线相关系数r^(2)为0.9994。结论 成功建立了一种性能良好的大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光探针PCR快速检测方法,该方法具有灵敏度高、特异性强、扩增时间短,仅为35 min的特点,可用于疑似大肠埃希氏菌O157:H7型污染样品的快速诊断检测。

大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制

本文采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金溶液标记大肠杆菌O157:H7抗体(6C1E5),然后将其包被于金标垫上,再将大肠杆菌O157:H7抗体(10G1A2)和兔抗鼠IgG分别包被于硝酸纤维素膜作为检测线和质控线,研制出的大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析快速检测试纸检测灵敏度达104 CFU/mL,并与鼠寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌等8种菌株无交叉反应,显示出较强的特异性。

国内外致泻大肠埃希氏菌O157:H7的检测标准比较及建议

致泻大肠埃希氏菌O157:H7(STEC O157:H7)是大肠埃希氏菌中致病性最严重的一种食源性致病菌,主要存在于牛肉、牛奶、水果及其制品中,对身体健康造成很大危害,甚至引发死亡。食品中STEC O157:H7检测尤为重要。本文对国内外STEC O157:H7的检测标准进行比较,提出我国标准在样品前处理、快速筛选方法的应用等方面需要加强,以便为该菌快速准确检测提供帮助,实现与国际标准化体系建设接轨,满足实验室检测需要。

肉制品中大肠埃希氏菌O157:H7实时荧光PCR检测方法的研究

以大肠埃希氏菌O157:H7菌体抗原基因rfbE基因为靶标,设计特异性引物和探针,建立大肠埃希氏菌O157:H7实时荧光PCR检测方法。对方法的特异性与灵敏性研究,并选取市售的10种肉类制品验证方法可行性。实验结果表明该方法具有良好的特异性和灵敏性,具有很好的研究价值和应用前景。

免疫磁分离结合胶体金免疫层析法快速检测大肠杆菌O157∶H7

以抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体偶联磁珠制得免疫磁珠;以胶体金标记的抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体为标记抗体,抗大肠杆菌O157∶H7多克隆抗体和驴抗鼠二抗分别作为检测线和质控线成分制备胶体金免疫层析试纸条。将免疫磁珠分离和胶体金免疫层析法相结合应用于大肠杆菌O157∶H7的现场快速检测中。结果表明:1 mL 7.6×103CFU/mL菌液经过免疫磁珠分离富集后,用胶体金免疫层析法检测可得到阳性结果。对于10 CFU/g大肠杆菌O157∶H7污染的食品样本,经过6 h预增菌,免疫磁珠分离和胶体金试纸条检测72 min即可检出。本方法的建立对于食品中有害物质的现场快速检测具有重要意义。

大肠杆菌O157:H7特异基因的实时荧光定量PCR检测

为建立快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chainreaction,RT-PCR)方法,针对大肠杆菌O157:H7的特异基因rfbE设计一对特异引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行灵敏度、重复性和特异性实验,同时与常规PCR方法进行比较。结果显示所建立的SYBRGreenⅠ实时定量PCR方法可以快速、特异地检测出大肠杆菌O157:H7,细菌纯培养物中其灵敏度可达2×101CFU/mL,临床模拟污染肉样中能最低能检测到1×102CFU/mL的大肠杆菌O157:H7。与常规PCR方法相比,SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法对临床样品中大肠杆菌O157:H7的检出率大大提高。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术能快速准确、特异、敏感地检测大肠杆菌O157:H7。

大肠杆菌O157∶H7微滴数字PCR定量方法的建立

以大肠杆菌O157∶H7（E.coli O157∶H7）rfb E基因为靶基因,建立了可对其准确定量的微滴数字PCR（dd PCR）方法。对dd PCR反应中的探针浓度进行了优化,考察了方法的线性范围、精密度、定量限和检出限。最终确定dd PCR反应中的最佳探针浓度为300 nmol/L。E.coli O157∶H7基因组DNA浓度范围为4-1.25×105拷贝/20μL dd PCR反应液时,dd PCR方法线性相关系数（R2）为0.999。当DNA浓度为760-88400拷贝/20μL时,方法的精密度最好（RSD〈5%）。本方法的定量限为4拷贝/20μL,检出限为3拷贝/20μL。特异性验证结果表明,建立的dd PCR方法特异性良好,对13份猪肉、牛肉和鸡肉样品的检测结果与定量PCR方法检出结果一致。

PCR法检测食品中大肠杆菌O157:H7

对大肠杆菌O157:H7型菌株的各毒力基因及基因组中的特异序列进行了设计和比对,确定292bp的检测引物。常规定性PCR和实时定量PCR证明该引物特异性强。模拟样品的前增菌实验结果表明本方法可以在原样品活菌浓度约2.0CFU/mL时通过16h增菌后检测出来,总的检测时间可以控制在24h内。本实验建立的PCR方法可用于食品中大肠杆菌O157:H7的快速测定。

免疫磁分离技术在E.coli O157∶H7检测中的应用

免疫磁分离(i mmunomagnetic separation)技术因其具有选择性好、特异性强、能起到浓缩的作用,已与其他快速检测方法如电化学、光学等方法连用,应用于食品、环境卫生检测等领域。免疫磁分离技术是目前最有推广价值的技术之一。文章通过比较不同的E.coli O157∶H7-免疫磁珠(immunomagnetic beads,I MB)浓度配比、E.coli O157∶H7与Bacillus subtilis不同的体积比下的免疫磁分离的捕获率,得出当E.coli O157∶H7-I MB浓度配比为1∶30时,捕获率近100%,即所有的目标菌均可被捕获到;在总体积不变、IMB的加入量一定的情况下,随着Bacillus subtilis比例的增加,捕获率出现先下降后上升的情况。同时,将IMS与ATP生物发光法结合起来,对不同浓度的E.coliO157∶H7进行了检测,得出该方法与传统的平板培养法具有很好的线性相关性,则R2=0.9882,检测限可低达102CFU.mL-1。

大肠杆菌O157:H7荧光微球免疫层析试纸条的研制

目的:建立快速、灵敏检测大肠杆菌O157:H7荧光微球免疫层析试纸条法。方法:以羧基化荧光微球作为标记物,共价偶联抗大肠杆菌O157:H7鼠源单克隆抗体,将大肠杆菌O157:H7兔多抗和驴抗鼠抗体喷涂于硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,以双抗体夹心反应模式制备大肠杆菌O157:H7荧光微球免疫层析试纸条。结果:通过优化实验确定偶联缓冲液为0.02mol/L pH5.0磷酸盐缓冲液,抗体偶联微球量为100μg/mg,试纸条可在加样5min后判读结果。制备的荧光微球试纸条对纯培养大肠杆菌O157:H7进行检测,肉眼观察检测限在1.2×104CFU/mL,借助荧光读取仪检测限能提高到6.1×103CFU/mL。试纸条除与金黄色葡萄球菌有微弱交叉反应外,与实验室保存的30株细菌无交叉反应。结论:大肠杆菌O157:H7荧光微球试纸条具有操作简便、快速灵敏、易于量化的特点,为该菌的检测提供了一种新型的手段。

肉类中大肠杆菌O157：H7多重PCR检测方法的建立

以编码大肠杆菌O157抗原的rfbE基因、编码H7抗原的fliC基因以及编码毒力因子的eaeA基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了检测大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系,扩增产物分别为291bp、625bp、368bp,采用30株细菌验证了该多重PCR具有特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到91.35pg;在存在干扰菌鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的情况下,当起始污染量为1.4CFU/mL时,37℃培养6h即可检出。在30份肉类样品中,有3份检出了大肠杆菌O157:H7。本研究建立的多重PCR方法可特异、灵敏地实现对大肠杆菌O157:H7的检测。

大肠埃希菌O157∶H7蜚蠊实验带菌消长的研究

目的 :采用EHECO15 7∶H7-EDL933株 ,体外染菌感染德国小蠊 (Blattelagermanica) ,观察其体内外感染和带菌消长情况。方法 :点滴法体外定量染菌 ,剂量为 1μl(菌悬液浓度为8.0× 10 5～ 1.9× 10 7(CFU /ml) ,并采用昆虫单虫单管方法饲养观察。结果 :蜚蠊经体外染菌 ,获得体内外带菌 ,体外带菌时间中位数为 ( 14 4 .0± 2 2 .17)h( 95 %CI :10 0 .5 5～ 187.45h) ;体内中位数为 ( 14 4± 2 5 .77)h( 95 %CI :93.48～ 194.5 2h) ;体内外带菌消长差异 ,无统计学意义( χ2 =1.46 ,P =0 .2 2 6 3)。德国小蠊最长带菌时间至少 2 16h( 9d)。结论 :蜚蠊不仅是EHEC -O15 7∶H7的贮存宿主和疾病传播的媒介 ,更重要的是潜在的人类感染的传染源。