黄芩汤及其减味方颗粒对感染大肠杆菌O78雏鸡肠道菌群和炎性反应相关性的影响

本试验以黄芩汤及其减味方颗粒饲喂人工感染大肠杆菌O78雏鸡后,研究肠道菌群与溶菌酶、炎症因子及Toll样受体间的相关性。首先,制备黄芩汤及其减味方颗粒,然后将19日龄伊莎褐雏鸡随机分为空白对照组(CG)、模型组(MG)、黄芩汤颗粒组(HQT)、黄芩汤减大枣颗粒组(ADZ)、黄芩汤减甘草颗粒组(AGC)、黄芩汤减白芍颗粒组(ASY)、黄芩汤减黄芩颗粒组(AHQ)、恩诺沙星组(ENR),每组10只。5个中草药组饲料中添加相应颗粒剂(500 mg/kg·BW)、恩诺沙星组添加量为10 mg/kg·BW,混饲7 d后,除空白对照组,其余7组的每只鸡胸肌注射0.6 mL大肠杆菌O78菌液,继续混饲5 d。试验结束后,16S rDNA测序法测定肠道菌群;ELISA法检测血清溶菌酶和炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α)水平;RT-PCR法检测脾脏Toll样受体(TLR4、TLR5、TLR15)相对表达量;采用Pearson法分析其相关性。结果表明:经黄芩汤及其减味方颗粒饲喂染病雏鸡后,其肠道菌群结构与溶菌酶、炎症因子含量及Toll样受体相对表达量间呈现一定的相关性。黄芩汤及其减味方颗粒可通过回调染病雏鸡肠道菌群结构,下调血清中溶菌酶、炎症因子水平以及脾脏Toll样受体相对表达量,从而达到治疗鸡大肠杆菌病的目的。试验结果可为黄芩汤及其减味方颗粒治疗鸡大肠杆菌病分子机制的系统研究提供参考依据。

月桂酸铜对禽致病性大肠杆菌O78感染蛋鸡生产性能、免疫和抗氧化功能以及肠道微生物区系的影响

试验旨在探究不同剂量月桂酸铜对禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC,E.coli)O78感染蛋鸡产蛋性能、蛋品质、免疫、抗氧化功能和回肠微生物的影响。将360只55周龄蛋鸡随机分为5处理组,阴性对照组(C)饲喂基础日粮且腹腔注射300μL生理盐水,阳性感染对照组(C+)饲喂基础日粮且腹腔注射300μL浓度为105CFU/mL的E.coliO78菌液,200(L+)、400(M+)、600 mg/kg(H+)月桂酸铜感染组分别饲喂基础日粮中添加200、400、600 mg/kg月桂酸铜的日粮且腹腔注射300μL浓度为105CFU/mL的E.coliO78菌液。结果表明:与C组相比,单纯E.coliO78感染组蛋鸡的产蛋率、平均日采食量、平均日产蛋重、合格蛋率和蛋形指数均降低(P<0.05),而死亡率和肝脏E.coli负载增加(P<0.05)。与C+组相比,添加月桂酸铜线性地提高了E.coli O78感染蛋鸡蛋形指数(P<0.05),线性降低了蛋重和肝脏E.coli载量(P<0.05);蛋黄颜色、回肠中E.coli和沙门氏菌丰度以及肝脏丙二醛(MDA)含量与月桂酸铜添加剂量呈现显著的二次效应(P<0.05);添加低剂量月桂酸铜上调了感染蛋鸡肝脏的热应激蛋白60(HSP60)mRNA表达,下调了白介素8(IL-8)mRNA表达(P<0.05)。因此,日粮补充200 mg/kg月桂酸铜对大肠杆菌O78感染引起的蛋鸡产蛋性能的下降、肠道菌群紊乱、肠道炎症和氧化应激有缓解作用,而中、高剂量的月桂酸铜会加重O78诱发的炎症反应和氧化应激。

屎肠球菌NCIMB11181对大肠杆菌O78感染肉鸡生产性能、肠道微生物和血液抗氧化功能的影响

试验旨在研究饲粮添加屎肠球菌对禽大肠杆菌O78感染肉鸡生产性能、肠道微生物菌群和血液抗氧化功能的影响。选取288只1日龄罗斯308母鸡,随机分成4组。分别在各试验组基础饲粮中添加0、100、200、300 mg/kg屎肠球菌。各试验组在11日龄均气囊接种禽大肠杆菌,0.2 mL/只。结果表明:与无添加组相比,(1)饲粮中添加屎肠球菌可线性提高10日龄肉鸡体重(BW)(P<0.05),线性及二次线性提高22和35日龄肉鸡BW(P<0.05),线性提高1~10、10~22和10~35日龄肉鸡平均日增重(P<0.05),降低感染后肉鸡死亡率。(2)饲粮中添加屎肠球菌可线性降低感染后3 d盲肠大肠杆菌和沙门菌数量(P<0.05),线性及二次线性降低双歧杆菌数量(P<0.05);感染后7 d,屎肠球菌添加组大肠杆菌和沙门菌数量线性降低(P<0.05)。(3)感染后3和7 d,屎肠球菌组血清总抗氧化能力分别呈线性(P<0.05)和二次线性降低(P<0.05);血清丙二醛含量均呈线性及二次线性降低(P<0.05);谷胱甘肽过氧化物酶活性均为二次线性降低(P<0.05)。由此可见饲粮添加屎肠球菌可缓解禽大肠杆菌O78感染导致的肉鸡生产性能下降,通过调节肠道菌群结构和机体氧化状态,来减轻大肠杆菌感染造成的生理失衡。提示饲粮添加200 mg/kg屎肠球菌可有效预防肉鸡大肠杆菌O78感染。

黄芪甲苷调节鸡异嗜性粒细胞吞噬和杀伤大肠埃希菌O78作用的体外研究

用涂板菌落计数和激光共聚焦方法观察中药单体黄芪甲苷作用后的鸡异嗜性粒细胞吞噬和杀伤鸡大肠埃希菌O78能力的变化,结果显示,黄芪甲苷在5μg/mL有极显著提高异嗜性粒细胞吞噬大肠埃希菌O78的作用(P<0.01),并且在异嗜性粒细胞发挥杀伤作用12h后有极显著增强其杀伤作用的功效(P<0.01)。结果表明,黄芪甲苷能够提高异嗜性粒细胞吞噬、杀伤大肠埃希菌O78的活性,从而起到增强机体抗病能力,提高机体免疫力的作用。

鸡大肠杆菌O78对喹诺酮类药物高耐药株的分子鉴定

就临床分离的鸡大肠杆菌O 78对喹诺酮类药物的最低抑菌浓度(M IC)进行了测定,得到对喹诺酮类药物有不同耐药水平的细菌23株。根据G enB ank已公布的QRDR s序列,设计了分别扩增gyrA、gyrB、parC和parE基因的4对引物,以筛选的23株耐药菌DNA为模板,进行了PCR扩增。序列分析及A crA的W estern b lotting检测结果表明,临床分离的鸡大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药水平与G yrA和ParC的突变密切相关,而A crAB外输泵的表达水平无显著变化。提示临床分离的鸡大肠杆菌O 78的耐药水平与喹诺酮类药物的选择性压力有关,它诱导了DNA旋转酶和拓扑异构酶IV的基因突变,可能不能激活A crAB外输泵。

鸡粪中沙门氏菌和大肠杆菌O78多重PCR检测方法的建立

为建立同时快速检测沙门氏菌和大肠杆菌078的方法，本研究根据沙门氏菌invA基因和大肠杆菌O78O-抗原特异基因序列设计引物，并在细菌16SrDNA区设计内参引物，通过各项参数调整优化，建立了能够直接从样品中同时检测沙门氏菌和大肠杆菌078的多重PCR检测方法。结果显示：该方法可以同时扩增出0781113bp和沙门氏菌821bp的特异片段以及细菌16SrDNA527bp的通用片段，而对于其他13种肠道致病菌只能扩增出527bp的细菌同源片段，具有较强的特异性。该体系检测沙门氏菌和大肠杆菌O78的最低检出限分别为103cfu／mL和102 cfia／mL。增菌5h，鸡粪模拟污染菌样品中沙门氏菌和大肠杆菌078的检测灵敏度分别为10 3cfu／mL和10 2cfu／mL。本研究建立的检测方法能够在8h内完成鸡粪样品中两种靶标菌的快速检测，对于沙门氏菌和大肠杆菌078的鉴别诊断和快速检测具有重大意义。

云南羊源O78型大肠埃希氏菌的分离鉴定

巍山县某山羊养殖户,出生15 d内的羔羊出现共济失调等神经症状,死亡率高达85%。样品经阿卡班（AKA）、山羊病毒性关节炎-脑炎（CAE）、梅迪-威斯纳病（MV）、蓝舌病（BTV）real-time PCR及普通PCR检测均为阴性。样品（脑组织）划线接种于5%的绵羊血琼脂、营养琼脂及麦康凯琼脂培养基上,37℃培养24 h。结果：在5%的绵羊血琼脂、营养琼脂平板上生长出直径2~3 mm、稍凸、圆形、湿润、灰白色、边缘整齐、不透明的菌落;在麦康凯琼脂平板上菌落呈粉红色。经革兰氏染色镜检、细菌生化鉴定为大肠埃希氏菌,血清型鉴定为O78型。昆明小白鼠致病性试验显示,致病性较强,实验组25只小白鼠接种后48 h内全部死亡,并从死亡小白鼠肝脏和心血内成功回收到该株细菌。

穿心莲内酯提高异嗜性粒细胞吞噬和杀伤鸡大肠杆菌O78功能的体外试验

模拟大肠杆菌O78在血液中被鸡异嗜性粒细胞吞噬杀伤的过程,利用激光共聚焦和涂板菌落计数的方法研究中药单体成分穿心莲内酯对异嗜性粒细胞吞噬杀伤大肠杆菌O78活性的影响。结果显示,穿心莲内酯质量浓度为1mg/L时有极显著的提高异嗜性粒细胞吞噬大肠杆菌O78的作用(P<0.01),并且在异嗜性粒细胞发挥杀伤作用的12h后有极显著的增强其杀伤作用的功效(P<0.01)。结果表明,穿心莲内酯能够提高异嗜性粒细胞吞噬、杀伤大肠杆菌O78的活性,从而起到增强机体抗病能力,提高机体免疫力的作用。

鸭大肠杆菌O78血清型强毒株分离鉴定及其高密度发酵新工艺

依据大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)持家基因PhoA PCR检测,从临床病料中分离鉴定出11株鸭致病性E.coli。经O抗原血清型鉴定以及毒力分析,筛选出1株O78血清型鸭E.coli强毒株EC-KP120427。以此菌株为基础,使用单因素法以及正交法,获得O78血清型鸭E.coli强毒株新型高密度发酵培养基,配方中初糖采用甘油替代葡萄糖,无机盐仅添加磷酸氢二钾,同时补充铁、锰、铝3种微量元素,在普通摇床上37℃培养菌液D600 nm可达到9.0以上。使用赛多利斯5 L发酵罐,对EC-KP120427菌株进行发酵培养试验。使用优化的新型高密度发酵培养基,按1∶10比例接种对数生长期种子菌,菌液D600 nm值为1.0、控制温度37℃、pH 7.0、调节空气通气量1.5~5.0 L/min、转速100~400 r/min、发酵至对数生长期以15 mL·h-1·L-1流速慢速流加50%葡萄糖溶液,培养菌液D600 nm值可高达30.0以上,成功实现了O78血清型鸭E.coli强毒株高密度发酵。本研究为致病性E.coli高密度发酵技术标准的建立奠定基础,同时为水禽E.coli细菌疫苗的改进提供了技术支持。

选择性捕获禽病原性大肠杆菌体内转录序列

采用选择性捕获转录序列(SCOTS)方法鉴定禽病原性大肠杆菌E037株(血清型O78)在感染SPF鸡过程中的转录表达基因。通过总RNA分离、cDNAs合成、PCR扩增和SCOTS对cDNAs选择和致病性特异转录序列的富集,致病性特异的cDNAs被分离鉴定,共获得31个转录序列(命名为aec),其中分别有2、1、4、14、2和8个aec序列与黏附素、LPS的合成、铁的摄取系统、质粒编码基因、噬菌体编码基因和一些其它功能基因相关;从气囊中分离到16个aec序列,心包膜中分离到15个aec序列;有3种与质粒编码基因相关序列在气囊和心包膜中都被分离到。结果显示APEC致病性特异序列包括黏附素、LPS的合成、铁的转运、质粒编码基因、噬菌体编码基因和一些其它功能基因等。通过SCOTS方法建立了一种体内表达致病性特异基因的方法和APEC在自然宿主感染模型中致病性相关基因的表达谱的筛选方法。

黄连组方对大肠杆菌O_(78)的抑菌作用与临床疗效研究

为研究防治鸡大肠杆菌病的新方法,减少抗生素的使用及耐药菌株的产生,试验选取黄连、乌梅、白术等中药制成黄连组方口服液,检测其对大肠杆菌O_(78)的抑制作用与临床疗效。体外试验采用最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)检测口服液抑菌效果;应用流式细胞仪观察口服液对细菌死亡率的影响;利用扫描电镜和透射电镜观察口服液对菌体形态与结构的影响;临床试验检测口服液对鸡大肠杆菌病的治疗效果及免疫器官指数的影响。结果显示,口服液对大肠杆菌的MIC为62.5mg/mL,MBC为250mg/mL;流式细胞仪检测可见口服液组大肠杆菌的死亡率为74.1%,空白对照组大肠杆菌死亡率为37.2%;扫描电镜下可见口服液处理组的菌体溢缩、断裂,形成许多残体;透射电镜下可见菌体变形,质壁分离现象。临床疗效显示,黄连组方治愈率为86.67%,而西药组治愈率为63.33%;空白对照组和西药组脾脏指数与模型组差异极显著(P<0.01),空白对照组、西药组、黄连组方高剂量组的法氏囊指数极显著高于模型组(P<0.01),模型组的胸腺指数显著低于其余各组(P<0.05)。本试验结果表明,黄连组方可使菌体发生变形、溢缩断裂、质壁分离等变化达到杀菌效果,并可通过提高动物体免疫力来防治雏鸡大肠杆菌病。

酸马奶提取植物乳杆菌DSM20174细菌素的理化特性研究

为研究从酸马奶中提取的植物乳杆菌DSM20174细菌素的理化特性,本试验提纯植物乳杆菌DSM20174细菌素,经过硫酸铵沉淀、透析后得到细菌素粗提液,再利用SephadexG-100凝胶柱层析进行纯化后,细菌素的比活力明显增加,达到154.70AU/mL,得率为43.5%。采用牛津杯法测定纯化的植物乳杆菌DSM20174细菌素在3种不同方式处理下对牛源野生致病性大肠杆菌O78抑菌效果的影响。结果显示：1植物乳杆菌DSM20174细菌素在5组温度处理下,随着温度的升高抑菌作用降低,各组抑菌作用差异显著（P〈0.05）。即使121℃处理30min后,抑菌直径仍达14.90mm。2植物乳杆菌DSM20174细菌素在pH 2.0-12.0由低到高的11组酸碱处理下,pH越大抑菌直径越小,且除了pH 9.0和pH 10.0之间差异不显著（P〉0.05）外,其余各组抑菌作用均差异显著（P〈0.05）。3植物乳杆菌DSM20174细菌素经胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶3种酶处理后抑菌直径变化明显,处理前后抑菌作用均差异显著（P〈0.05）。结果表明植物乳杆菌DSM20174细菌素是较好的抑菌活性物质,但不是热稳定性物质;具有较广泛的pH适用范围,且pH越小时其抑菌活性越强,在最适生长pH时抑菌活性有所增强;不是蛋白酶稳定性物质。

禽大肠杆菌O_2、O_(78)菌株外膜蛋白A基因扩增及序列分析

根据Genbank中大肠杆菌K 12外膜蛋白A基因的核苷酸序列设计引物,从禽大肠杆菌O2、O78及它们的融合株O2,78(ChlrNorr)中分别扩增得到外膜蛋白A基因(ompA),进行序列测定及分析发现3个菌株的ompA均由2276nt组成,核苷酸序列完全相同,只有一个大的开放性阅读框(ORF),长1041bp,编码由346个氨基酸组成的前外膜蛋白A(pro OmpA),前21个氨基酸残基组成信号肽,成熟的OmpA由325个氨基酸残基组成,相对分子质量为37000.其氨基酸序列也完全相同.从基因水平上证明了禽大肠杆菌O2和O78菌株存在相同的外膜蛋白A抗原.

12味中药对鸡血清型O_(78)大肠杆菌的抗菌活性观察

本研究旨在观察乌梅、芦荟等12味中药的水煎液对鸡致病性大肠杆菌O78的抗菌活性。选取乌梅、芦荟等12味中药加水煎煮以获得中药水提取物,测定其对鸡致病性大肠杆菌O78的最低抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC),并对体外抑菌效果较好的单味中药进行体内试验。乌梅、芦荟、白头翁抗菌活性较好,桔梗、连翘、大黄、白芍、白术几乎无抗菌活性,其中乌梅、白头翁与芦荟水提取物对鸡致病性大肠杆菌O78的MIC分别为2.57、2.06和2.31mg/mL。乌梅、芦荟、白头翁具有一定的抗鸡致病性大肠杆菌O78的作用,将为开发新的抗鸡致病性大肠杆菌的药物奠定理论基础。

香附酮抑制鸡致病性大肠杆菌诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞炎症作用的研究

本试验通过建立鸡致病性大肠杆菌O78(APEC-O78)感染的鸡肺泡Ⅱ型上皮细胞的体外炎症模型,研究了不同浓度香附酮对TNF-α、IL-10分泌及TLR-4和TLR-5mRNA表达水平的影响。结果显示,0.5μg/mL香附酮能显著降低TNF-α的分泌水平(P<0.05),同时1μg/mL香附酮能极显著促进IL-10的分泌(P<0.01)。0.1、0.5和1μg/mL香附酮均能极显著降低TLR-4mRNA的表达水平(P<0.01),而不影响TLR-5mRNA的表达水平(P>0.05)。结果表明,香附酮可能通过TLR-4受体信号通路,抑制APEC-O78感染的鸡肺泡Ⅱ型上皮细胞促炎因子的产生,增加抑炎因子的产生,进而发挥其抗炎作用。

β-1,3-葡聚糖对感染大肠杆菌肉鸡肠道氧化还原状态、菌群状态和免疫功能的影响

试验选择90只1日龄AA肉鸡随机分成3组,分别饲养于隔离器中。处理1和2饲喂基础日粮,处理3饲喂添加葡聚糖的试验日粮。处理2和3在8、9和10日龄连续口服感染大肠杆菌O780.5mL(浓度为1×1010cfu/mL)。处理1组鸡在8、9和10日龄口腔接种等剂量的灭菌PBS。结果表明,大肠杆菌O78感染会显著降低鸡生长速度(P<0.05),提高死亡率,使感染初期小肠氧化损伤,显著降低肠道乳酸菌数和肠道sIgA量(P<0.05),但显著提高感染初期血清特异性IgG和感染后期空肠sIgA和血清特异性IgG水平(P<0.05)。而日粮添加葡聚糖降低肉鸡死亡率,缓解因感染引起的生长速度降低,减轻肠道氧化损伤,增强肠黏膜抗氧化能力,显著提高感染后期肠道乳酸细菌数量和感染后期血清特异性IgG水平。

锡林郭勒盟地区酸马奶提取的植物乳杆菌DSM20174的理化特性研究

为研究从内蒙古锡林郭勒盟地区酸马奶中提取的植物乳杆菌DSM20174的抑菌能力和抑菌活性物质的特性，采用牛津杯法将植物乳酸杆菌的菌液和发酵上清液在3种处理方式下，对牛源野生致病性大肠杆菌O78。的抑菌效果进行分析。结果表明：植物乳杆菌DSM20174的菌液和发酵上清液即使在121℃，30min处理后，抑菌直径达仍达到14．10和14．40mm；在pH=2．0时，菌液和发酵上清液的抑菌直径为21．9和22．1mm；而当pH：4．0时抑菌活性明显下降，前者为14．8mm，后者为14．9mm；pH5．0～7．0时，抑菌直径为0：二者分别经胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的反应后，处理前组和处理后组抑菌直径变化均不明显。在3种处理方式下，发酵上清液的抑菌直径均大于同组的菌液的抑菌直径。因此，植物乳杆菌DSM20174是一种较好的抑菌活性物质和热稳定性物质，随着温度和时间的升高，抑菌活性降低。其在pH〈5．0的条件下有抑菌活性，随pH的升高抑菌活性降低，pH越小时抑菌活性越强，pH≥5．0时失去抑菌活性。对蛋白酶不敏感。在相同条件下，发酵上清液的抑菌作用强于菌液。

伴大豆球蛋白水解肽对鸭抗大肠杆菌感染的作用

研究灌服伴大豆球蛋白水解肽的麻鸭,在肌肉注射大肠杆菌O78后的健康状况,并分析有关细胞因子水平的变化。结果表明,感染对照组出现典型的大肠杆菌病病理变化,而灌服伴大豆球蛋白水解肽的鸭只临床症状较轻。与感染对照组比较,伴大豆球蛋白水解肤能显著提高鸭脾脏IL-2水平与肠道黏膜slgA水平,显著降低脾脏TNF-α水平,说明伴大豆球蛋白水解肽能提高动物机体免疫机能,抵御外源性大肠杆菌的侵袭感染,预防胃肠道疾病的发生。

一株鸭源大肠杆菌致病性及毒力因子检测

从新疆某鸭场的病鸭中分离到1株大肠杆菌,"O"抗原血清学鉴定为O78,药敏试验结果显示该分离株已产生较高程度的耐药性。对鼠疫菌素受体基因fyuA、铁调节蛋白基因irp2、LEE致病岛转录活化因子ler、紧密粘附素eaeA、Ⅰ型菌毛必须蛋白基因fimC、P型菌毛结构基因papA和血清耐受基因iss进行基因测序分析,结果表明该株细菌存在强毒力基因(high-pathogenicity island,HPI)。动物实验表明,该菌可引起雏鸭发生急性全身败血症;10日龄雏鸭半数致死量为2.0×105CFU/ml,表明该菌具有高致病性。