针对SP1的圈套寡脱氧核苷酸抑制NIH_3T_3细胞活力和Ⅲα_1胶原基因表达的研究

目的:研究针对转录因子SP1的圈套寡脱氧核苷酸(Decoy-Oligodeoxynucleotide,Decoy-ODN)对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)的活力和Ⅲα1胶原基因表达的影响,探讨圈套寡脱氧核苷酸用于病理性瘢痕基因治疗的可能性及机理。方法:设计合成针对SP1的特异性哑铃形Decoy-ODN。用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞。分别用流式细胞仪检测ODN转染效率,激光共聚焦显微镜观察ODN在细胞中的分布,电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证ODN与SP1的特异性结合。用WST-8检测ODN对细胞活力的影响。用RT-PCR检测ODN对细胞胶原基因表达的抑制作用。结果:分别转染25nM、50nM、100nM、150nM SP1 Decoy-ODN,48h后,细胞活力依次为0.9331±0.0203、0.7479±0.0868、0.577±0.0347、0.4703±0.0147;转染100nMSP1Decoy-ODN可明显抑制Ⅲα1胶原mRNA的表达(P<0.01),抑制效果达60%。结论:Decoy-ODN可以通过拮抗核转录因子SP1的活性而抑制NIH3T3细胞的活力和Ⅲα1胶原基因的表达。

CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)协同促进脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞增殖与迁移

目的探讨CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞增殖与迁移能力的影响及机制。方法使用1 mg/L LPS处理小鼠RAW264.7巨噬细胞建立体外炎症细胞模型,采用CCK-8法检测CpG ODN(500 nmol/L)对LPS诱导的巨噬细胞增殖的影响,采用TranswellTM实验检测CpG ODN对细胞迁移能力的影响;采用Western blot法检测p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、胞外信号调节激酶(ERK)、核因子κBp65(NF-κB p65)的蛋白磷酸化水平,同时使用以上通路的抑制剂SB203580、SP600125、PD98059、BAY11-7082,探讨CpG ODN发挥效应的机制;采用实时定量PCR检测CpG ODN对LPS诱导产生的单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、环加氧酶2(COX2)mRNA水平的影响。结果CpG ODN协同促进LPS诱导的巨噬细胞增殖与迁移,并促进COX2、MCP-1的转录,增强JNK、ERK信号通路蛋白的磷酸化水平,并且JNK与ERK信号通路激酶抑制剂可有效降低CpG ODN的协同效应。结论CpG ODN可通过JNK与ERK途径协同促进LPS诱导的巨噬细胞增殖与迁移并促进COX2、MCP-1的转录。

C型CpG单链寡核苷酸对肿瘤疫苗抑瘤效果的增强作用

目的研究C型CpG单链寡脱氧核苷酸(CpG ODN)对肿瘤疫苗抑瘤效果的增强作用。方法利用体外淋巴细胞增生实验和病毒保护实验确定新C型CpG ODN,采用小鼠体内抑瘤实验观察CpG ODN对肿瘤疫苗HSP65-MUC1重组蛋白抑制MUC1阳性肿瘤生长的增强作用,并对小鼠血清中抗HSP65-MUC1抗体的类型进行了初步鉴定。结果自行设计的CpG ODN BW005能刺激人PBMC和小鼠脾细胞增生,其刺激后的培养上清具有保护Vero E6细胞免受VSV感染的作用,属于新型C型CpG ODN。将BW005与HSP65-MUC1联合应用于C57BL/6小鼠后,MUC1阳性肿瘤的发生明显延缓(平均44.8d),其终末肿瘤发生率最低(33.33%);荷瘤小鼠的生存期明显延长(平均49.5d),其终末生存率最高(66.67%)。小鼠血清中抗HSP65和抗MUC1的IgG2a抗体水平增加。结论C型CpG ODN可以增强肿瘤疫苗HSP65-MUC1的抑瘤效果,考虑与小鼠体内Th1环境的形成有关。

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人肝癌细胞株乙酰肝素酶表达的影响

目的:探讨乙酰肝素酶(Hpa)反义寡脱氧核苷酸对人肝癌细胞株Hpa mRNA和蛋白表达的影响。方法:设计合成互补于Hpa mRNA起始密码区的硫代反义寡脱氧核苷酸AS-ODN及相应的无义对照寡脱氧核苷酸NS-ODN,以阳离子脂质体Oligofectamine^(TM) Reagent包埋后转染SMMC-7721、BEL-7402细胞,以RT-PCR和Western-blot检测转染前后细胞Hpa mRNA以及蛋白表达的变化。结果:与正常对照组和NS-ODN相应浓度组相比,转染AS-ODN组肝癌细胞Hp amRNA和蛋白的表达均下降。结论:Hpa反义寡脱氧核苷酸下调Hpa mRNA和蛋白的表达,可能抑制肝癌的侵袭转移。

免疫活性寡脱氧核苷酸CpG ODN的研究进展

早在1890年就观察到给癌症患者注射菌体粗提制剂有时可使肿瘤明显退缩，但不明其原因。直到20世纪80年代，在提取菌体中对肿瘤起作用的活性成分时，发现卡介苗中这种活性来自于菌体的核酸组分。用核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶降解分析，证明真正起作用的是菌体中脱氧核糖核酸（DNA）。而对DNA进行部分降解分析，发现40bp左右或更小的片段就可具备这种活性。

12-bpCpG ODN通过NO途径增强人脑胶质唐细胞U87放射增敏作用的研究

目的：探讨含12-bp的CpG寡脱氧核苷酸（CpGODN107，CpG107）（对脑胶质瘤细胞U87（WHOgradeIV）的放射增敏作用，并探讨其放射增敏机制。方法：本研究通过MTT法检测CpG107对U87细胞的放射增敏作用；

含CpG基序的寡脱氧核苷酸联合乙型肝炎表面抗原免疫转基因小鼠的实验研究

有研究表明,含CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides,CpG ODN)对天然和获得性免疫系统具有广泛的刺激作用,在动物体内可作为多种外源抗原,包括乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的Th1型免疫佐剂,达到增强体液免疫及细胞免疫的作用,而Th1型免疫反应对乙型肝炎病毒(HBV)的清除是必要的,因此CpG ODN联合HBsAg可望成为慢性乙型肝炎的有效治疗性疫苗.

MT01对牙龈卟啉单胞菌感染成骨细胞MG63中Ⅰ型胶原mRNA表达的促进作用及其意义

目的:检测单链寡脱氧核苷酸MT01作用下牙龈卟啉单胞菌(Pg)感染成骨细胞MG63中Ⅰ型胶原(ColⅠ)mRNA表达水平,探讨MT01对感染状态下成骨细胞成骨向分化的影响。方法:体外培养的MG63细胞分为空白对照组、MT01组、Pg组和MT01+Pg组。按分组情况进行相应处理,加入MT01(质量浓度1mg·L-1),以1mg·L-1PBS作对照共孵育3h后,以100∶1的感染复数(MOI)加入Pg悬液共培养。4组细胞分别孵育2、4、6、8、12和24h后采用RT-PCR法检测MG63细胞中ColⅠmRNA表达水平。结果:与空白对照组比较,MT01和MT01+Pg组MG63细胞中ColⅠmRNA表达水平在2和4h时无明显变化(P>0.05),8、12和24h时MT01组细胞中ColⅠmRNA表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01);与Pg组比较,2和4h时MT01+Pg组细胞中ColⅠmRNA呈低表达,6、8、12和24h时ColⅠmRNA表达水平升高(P<0.05或P<0.01)。结论:MT01上调感染状态下MG63细胞中ColⅠmRNA的表达水平,MT01可促进感染状态下成骨细胞成骨向分化。

CpG DNA在寄生虫感染免疫中的作用

近年研究发现,细菌胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpGDNA)和合成的含CpG序列的寡脱氧核苷酸(CpG 0DN)具有强烈的非特异性的免疫刺激作用,其共同特征为都含有一些具有免疫学活性的短核苷酸序列.

纳米复合佐剂的抗肿瘤免疫调控作用及效果研究

目的:探究纳米复合佐剂在肿瘤内的免疫调控作用及抗肿瘤效果。方法:制备包载CpG的β葡聚糖纳米颗粒(CNP),体外培养小鼠骨髓来源的树突细胞(BMDC),分5组进行体外免疫处理,分别为PBS对照组、β葡聚糖组、β葡聚糖纳米载体(NP)组、CpG组和CNP组,利用流式仪分析BMDC成熟情况。将体外培养的黑色素瘤B16F10细胞接种于C57BL/6N小鼠右后肢皮下,建立肿瘤模型,第6 d挑选肿瘤大小相对一致的24只小鼠均分为4组,即PBS组、NP组、CpG组、CNP组进行治疗,后颈部皮下注射给药,共给药4次,每次间隔3 d,期间隔天测量肿瘤体积,最后一次给药后第3 d眼眶取血,测定血浆中γ干扰素(IFN-γ)浓度,处死小鼠后分离肿瘤及脾脏,流式细胞术检测瘤内浸润性T淋巴细胞比例及脾脏内T细胞比例。结果:CNP佐剂处理后BMDC成熟比例约为CpG佐剂组的2.8倍。在小鼠体内接种肿瘤15 d后,CNP治疗组肿瘤体积较其他组均减小,血浆中IFN-γ含量显著高于其他实验组,约为CpG组的1.5倍,肿瘤浸润性T淋巴细胞与其他组相比也有明显升高。结论:构建的葡聚糖-CpG纳米复合佐剂能够有效激活BMDC,改善肿瘤微环境,具有良好的体内抗肿瘤效果。

AntisenseGAD_(67)ODN对戊四氮所致慢性癫癇大鼠的作用

目的 :探讨谷氨酸脱羧酶 (GAD)的抗癫疒间作用。方法 :采用戊四氮制备大鼠慢性癫疒间 模型 ,利用反义寡脱氧核苷酸技术 ,通过选择性地抑制海马GAD基因的表达来观察其对慢性癫疒间大鼠行为、发作阈值及脑电图的影响。结果 :给予AntisenseGAD67ODN处理后 ,GADmRNA表达下降、GABA浓度下降、疒间 性发作潜伏期缩短、发作程度加重及脑电图疒间 波频率增加。结论 :从反面进一步说明GAD基因可能是抗疒间基因 。

核因子κB诱捕抑制白细胞介素-1β诱导的软骨细胞生成一氧化氮的实验研究

目的探讨用核因子诱捕(decoy)方法抑制软骨细胞生成一氧化氮(NO)的可行性。方法培养大鼠软骨细胞,人工合成大鼠诱生型一氧化氮合酶(iNOS)基因上能够与核因子(NF)-κB序列识别和结合并带有荧光标记的特异性双链寡脱氧核苷酸(ODN)序列NF-κBdecoyODN,将不同浓度的NF-κBdecoyODN转染入培养的大鼠软骨细胞,通过荧光显微镜观察其转染效率及降解情况,检测其对白细胞介素(IL)-1β诱导的软骨细胞NO生成及iNOSmRNA转录的影响。结果NF-κBdecoyODN能转染入软骨细胞胞核并能维持一定时间,其中4μmol/L以上浓度的NF-κBdecoyODN能够有效抑制IL-1β诱导的软骨细胞iNOSmRNA的转录及NO生成。结论NF-κBdecoyODN能够转染入软骨细胞并抑制IL-1β诱导的软骨细胞iNOSmRNA的转录及NO生成,为抑制NO的生成提供了新的思路和方法。