OEPR法构建含不同破伤风毒素T细胞表位的CPB表达质粒及其产物的初步鉴定

为了提高产气荚膜梭菌β毒素(CPB)亚单位疫苗的免疫效果,试验将不同破伤风毒素辅助性T细胞表位引入该蛋白前,用OEPR(Overlap Extension PCR and Recombination)法构建了8个重组表达质粒(即p Cold-CPB、p Cold-P2-CPB、p Cold-P21-P30-P2-CPB、p Cold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB和p ET22b-CPB、p ET22b-P2-CPB、p ET22b-P21-P30-P2-CPB、p ET22bP32-P23-P21-P30-P2-CPB)。将阳性重组质粒转入到大肠杆菌中,以自诱导培养基表达目的蛋白。SDS-PAGE分析结果表明,8个重组菌均成功表达出目的蛋白,且大小均与预期一致。Western Blotting检测结果表明,重组蛋白均可被C型产气荚膜梭菌阳性血清识别。毒性试验结果表明,重组蛋白均可致死小鼠。本研究首次用OEPR法成功构建了8个含不同破伤风毒素T细胞表位的产气荚膜梭菌β毒素表达质粒,并成功表达了目的蛋白,为探索破伤风毒素辅助性T细胞表位对产气荚膜梭菌β毒素免疫效果的影响及进一步开发亚单位疫苗奠定了基础。

OEPR法构建mETX-mCPA表达质粒及其重组蛋白的免疫效果评价

为了确定产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)和α毒素(CPA)无毒突变体作为亚单位疫苗同时预防D型和A型产气荚膜梭菌病的免疫效果,试验用点突变结合OEPR法构建重组质粒pET32a-mETX-mCPA。将阳性重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中,以预先添加乳糖的自诱导培养基表达目的蛋白。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白相对分子质量约为92 000,与预期值一致。Western blot检测结果表明,重组蛋白可被A型产气荚膜梭菌阳性血清所识别。致死性试验结果表明,重组蛋白不致死小鼠。以铝胶为佐剂将重组蛋白免疫家兔,二免血清0.1 mL可分别中和3个小鼠MLD的A型毒素和100个小鼠MLD的D型毒素。本研究用OEPR法成功构建了无毒突变体pET32a-mETX-mCPA质粒,获得的重组蛋白在家兔上显示出良好的免疫效果,为研发A、D型产气荚膜梭菌二价亚单位疫苗奠定理论基础。