瑞马唑仑调节HIF-1α/BNIP3信号通路对OGD/R诱导神经细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨瑞马唑仑对OGD/R诱导的神经细胞自噬和凋亡的影响及作用机制。方法体外培养小鼠海马神经元细胞(HT22)并进行神经细胞氧糖剥夺/再复氧(OGD/R),筛选实验用瑞马唑仑浓度;将HT22细胞分为对照组、OGD/R组、瑞马唑仑组、2-ME2组、瑞马唑仑+2-ME2组;CCK8法检测5组HT22细胞活力;流式细胞术检测5组HT22细胞凋亡率;透射电子显微镜观察5组HT22细胞自噬小体的形成;Western blot检测5组HT22细胞HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达。结果确定实验用瑞马唑仑浓度为50μg/mL;与对照组比较,OGD/R组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05);与OGD/R组比较,瑞马唑仑组HT22细胞自噬小体增加,OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平上调,凋亡率下调(P<0.05);2-ME2组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05)。与瑞马唑仑组比较,瑞马唑仑+2-ME2组HT22细胞自噬小体数量减少,OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05);与2-ME2组比较,瑞马唑仑+2-ME2组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平上调,凋亡率下调(P<0.05)。结论瑞马唑仑可通过激活HIF-1α/BNIP3信号通路促进OGD/R诱导的神经细胞自噬,抑制细胞凋亡,从而减轻OGD/R诱导的神经细胞损伤。

右美托咪定通过抑制RIPK/MLKL通路减轻OGD/R诱导的神经元坏死性凋亡

目的评价右美托咪定对氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)诱导的HT22神经元细胞坏死性凋亡的影响。方法体外培养HT22小鼠海马神经元细胞,建立OGD/R模型。细胞分为对照组,OGD/R模型组,右美托咪定低、中、高浓度组(2.5、5、10μM)。采用CCK-8测定细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞上清LDH含量,流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-qPCR和免疫印迹检测坏死性凋亡关键因子受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)和混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)的mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组比较,OGD/R模型组细胞存活率显著降低(P<0.001),上清LDH含量和细胞凋亡率、RIPK1和MLKL的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.01);与OGD/R模型组比较,右美托咪定5和10μM显著提高了细胞存活率,减少了LDH含量和凋亡率,下调RIPK1和MLKL的mRNA和蛋白表达水平(P均<0.01)。结论右美托咪定可减轻OGD/R诱导的神经元损伤,其机制可能与抑制RIPK1/MLKL通路介导的坏死性凋亡有关。

小续命汤对OGD/R诱导HT22细胞损伤后突触可塑性的影响

目的:探讨小续命汤(XXMD)对缺血性脑卒中后脑缺血再灌注损伤突触可塑性的影响。方法:体外建立小鼠海马神经元(HT22细胞)氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型,模拟脑缺血性脑卒中后海马神经元缺血再灌注损伤。采用CCK-8法检测HT22细胞活力,筛选XXMD最佳作用浓度。将HT22细胞随机分为对照组、OGD/R组和OGD/R+XXMD组,倒置荧光显微镜观察各组细胞形态变化,ELISA法测定细胞上清液中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平,透射电镜观察细胞超微结构改变,免疫荧光染色检测神经元标志物Neu N及突触相关蛋白NF200和MAP2的荧光强度,Western blot检测各组细胞中NF200和MAP2蛋白表达水平。结果:XXMD在浓度为100 mg/L时细胞活力最强(P<0.05)。与对照组相比,模型组细胞变圆皱缩,线粒体呈现肿胀甚至空泡样改变,活力明显下降(P<0.05),IL-1β、IL-6和TNF-α含量升高(P<0.05),NF200和MAP2的荧光强度及蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。而XXMD可改善细胞形态及超微结构,提升生存率(P<0.05),降低炎症因子水平(P<0.05)。免疫荧光染色及Western blot结果显示,与模型组相比,OGD/R+XXMD组可以增强NF200和MAP2平均荧光强度(P<0.05),提升蛋白表达水平(P<0.05)。结论:XXMD可以减轻OGD/R诱导的HT22细胞损伤,其机制可能涉及减轻炎症反应和增强突触可塑性。

姜黄素通过PINK1/Parkin通路减轻OGD/R诱导的脑微血管内皮细胞损伤

目的:探究姜黄素激活PINK1/Parkin通路增强线粒体自噬,改善氧糖剥夺再灌注(OGD/R)引起内皮细胞损伤的作用机制。方法:建立小鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)的OGD/R损伤模型,用不同浓度姜黄素处理内皮细胞,使用免疫荧光和透射电镜评估姜黄素对BMECs线粒体自噬的影响。细胞计数试剂盒8(CCK-8)、乳酸脱氢酶释放检测和跨内皮电阻值检测用于评估细胞增殖、损伤和屏障完整性。Western Blot检测姜黄素对PINK1/Parkin通路蛋白(LC-3 II/I、PINK1、Parkin及p62)表达的影响,采用Mdivi-1同时处理细胞,进一步确认线粒体自噬在姜黄素减轻OGD/R损伤中的作用。结果:姜黄素处理显著促进了线粒体自噬,并显著增加LC-3 II/I、PINK1和Parkin蛋白的表达(P<0.001),显著减少了p62蛋白的表达(P<0.001)。在OGD/R模型中,姜黄素显著提高了细胞增殖率(P<0.001),显著降低了乳酸脱氢酶释放(P<0.001),并显著改善了细胞屏障的电阻值(P<0.001)。而线粒体自噬抑制剂Mdivi-1可以逆转姜黄素的这些保护效果。结论:姜黄素通过激活PINK1/Parkin通路增强线粒体自噬,有效缓解BMECs在OGD/R条件下的细胞损伤。

大鼠大脑皮质神经细胞氧糖剥夺再复氧(OGD/R)后自噬对凋亡的抑制作用

目的 观察大脑皮质神经元氧糖剥夺再复氧(OGD/R)后自噬对凋亡的影响。方法 取18只出生在24 h内的新生SD大鼠,采用机械分离胰蛋白酶消化法提取大脑皮质神经元培养7 d后,建立OGD/R模型,随机分为3组,正常对照组、OGD/R组、OGD/R联合巴弗洛霉素A1(BafA1)组。采用CCK-8法和乳酸脱氢酶(LDH)实验检测细胞活力,用异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡,采用反转录PCR法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、 P62及胱天蛋白酶3(caspase-3)的mRNA表达,Western blot法检测LC3、 P62及caspase-3的蛋白表达。采用红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-LC3(RFP-GFP-LC3)腺病毒转染神经细胞检测自噬荧光强度,透射电子显微镜观察自噬体的超微结构变化。结果 与对照组相比,OGD/R组神经细胞活力明显降低,LDH释放水平明显升高,凋亡增加;LC3、 P62、 caspase-3的mRNA和蛋白表达增强;RFP荧光强度增加,自噬体增加且自噬溶酶体更加聚集,加用自噬晚期抑制剂BafA1后RFP荧光强度显著降低。结论 OGD/R诱导了神经元细胞的自噬和凋亡,抑制自噬后加重了神经细胞的损伤和凋亡。

黄芪甲苷基于PI3K/Akt/Bcl-2信号通路对PC12细胞OGD/R损伤的保护机制研究

目的:探究黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)对大鼠嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma 12,PC12)细胞缺氧缺糖复供(oxygen deprivation reoxygenation,OGD/R)损伤的保护作用及基于磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)及B 细胞淋巴瘤-2 蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2) PI3K/Akt/Bcl-2 信号通路的机制研究。方法:体外培养 PC12 细胞,细胞随机分为空白对照组、模型组(OGD/R),尼莫地平阳性对照组(5 μmol·L^-1)和黄芪甲苷组(1.00、0.10、0.01 μmol·L^-1),除空白组外其余各组均建立体外PC12细胞OGD/R模型。CCK-8试剂盒法检测PC12 细胞存活率;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒法测定乳酸脱氢酶的漏出量;采用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染法检测各组细胞凋亡与坏死情况;Western blot检测各组细胞Akt、p-Akt、Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)的蛋白表达情况。结果:黄芪甲苷提高PC12 细胞OGD/R 损伤的细胞存活率,降低LDH 漏出量和细胞凋亡。黄芪甲苷浓度依赖性上调p-Akt/Akt、Bcl-2的蛋白表达和下调促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达。PI3K/Akt通路的抑制剂LY2940002 能抑制黄芪甲苷对OGD/R损伤的PC12细胞中凋亡相关蛋白的影响。结论:黄芪甲苷对OGD/R损伤的PC12细胞具有保护作用,且其保护作用机制可能与PI3K/Akt/Bcl-2信号通路有关。

赶黄草活性部位对OGD/R致星形胶质细胞损伤的保护作用及其机制研究

为探究赶黄草活性部位EPC对OGD/R致星形胶质细胞损伤的保护作用及其初步机制,利用MTT法检测EPC对正常培养和OGD/R后星形胶质细胞活力的影响;Western blot法检测OGD/R损伤的星形胶质细胞内Nrf2、HO-1、ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK1/2和p-JNK1/2蛋白表达水平。结果表明:与空白对照组相比,不同浓度EPC对正常培养的星形胶质细胞均无细胞毒性,且80μg·mL-1 EPC可显著提高星形胶质细胞的活力;同时,与空白对照组相比,OGD/R组细胞中Nrf2、HO-1、p-ERK1/2、p-p38和p-JNK1/2蛋白表达水平显著升高;而与OGD/R组相比,10和20μg·mL-1 EPC可进一步上调Nrf2与HO-1蛋白表达水平,下调p-ERK1/2、p-p38和p-JNK1/2蛋白表达水平,对ERK1/2、p38和JNK1/2蛋白表达水平无影响。这提示EPC对OGD/R致星形胶质细胞损伤具有保护作用,其可能是通过抑制MAPK信号通路进而激活Nrf2/HO-1信号通路来实现的。

天麻蛋白对OGD/R诱导的HT22细胞损伤的保护作用及机制研究

目的研究天麻蛋白对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)诱导的HT22细胞损伤的保护作用及机制。方法将体外HT22细胞常规培养,生长至对数生长期后铺板并随机分为对照组、OGD/R组、依达拉奉组、天麻蛋白组。以连二亚硫酸钠(Na_(2)S_(2)O_(4))10 mmol·L^(-1)合并无糖DMEM培养基造成氧糖剥夺培养2 h,继而恢复为无血清高糖DMEM培养2 h进行复糖复氧处理,以建立体外OGD/R模型。依达拉奉和天麻蛋白为自氧糖剥夺前24 h开始即加入相应药物终浓度,持续至复糖复氧结束。采用MTT法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)法测定LDH泄露率,试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性,丙二醛(MDA)含量及活性氧(ROS)水平,流式细胞技术Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡,Western blot检测OGD/R诱导损伤的HT22细胞内Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3、p-AMPK、AMPK、Nrf2、Nrf2入核、HIF-1α、VEGF蛋白表达水平变化。结果与对照组相比,OGD/R组细胞存活率下降(P<0.01),LDH泄露率升高(P<0.01),SOD、GSH-PX活性下降(P<0.01),MDA含量及ROS水平增加(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.01),Bcl-2蛋白的表达量下降(P<0.01),Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达量升高(P<0.01);与OGD/R组相比,天麻蛋白可提高细胞存活率(P<0.01),降低LDH泄露率(P<0.01),提高SOD活性及GSH-PX活性(P<0.01),降低MDA含量及ROS水平(P<0.01),降低细胞凋亡率(P<0.01),上调HT22细胞中Bcl-2、p-AMPK、Nrf2入核、HIF-1α、VEGF蛋白的表达量(P<0.01),有效抑制Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达(P<0.01)。结论天麻蛋白对HT22细胞OGD/R损伤具有神经保护作用,其机制与活性氧/线粒体凋亡通路、AMPKNrf2通路和缺氧诱导因子通路相关蛋白密切相关。

丹参酮通过调控巨噬细胞分化保护OGD/R诱导的心肌细胞凋亡的作用

目的探讨丹参酮通过调控巨噬细胞分化保护OGD/R诱导的心肌细胞凋亡及相关机制。方法选用THP-1单核细胞株经佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)诱导为贴壁的巨噬细胞后,分为丹参酮低剂量组(1μg/ml)、丹参酮中剂量组(2μg/ml)和丹参酮高剂量组(4μg/ml),荧光定量PCR检测M1型和M2型巨噬细胞活化相关基因表达。采用巨噬细胞和心肌细胞共培养的方式探索巨噬细胞的分化对OGD/R诱导的心肌细胞凋亡的影响,Tunel染色检测心肌细胞凋亡情况,Western blot检测心肌细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl2和Caspase3表达以及NF-κB信号通路相关蛋白p-IKB、IKB、p-P65和P65表达。使用NF-κB信号通路激动剂探索巨噬细胞的分化对OGD/R诱导的心肌细胞凋亡影响的相关机制,进行上述相同的检测。结果丹参酮低、中和高剂量都可抑制M1型巨噬细胞分化相关基因表达,促进M2型巨噬细胞分化相关基因(P<0.05),其中丹参酮中剂量效果最佳(P<0.01)。相关机制研究发现,丹参酮可通过调控巨噬细胞分化过程抑制OGD/R诱导的心肌细胞凋亡(P<0.05)以及凋亡相关蛋白Bax/Bcl2和Cleaved-caspase3/Caspase3表达(P<0.05)。相关信号通路研究发现,M2型巨噬细胞活化相关因子主要通过影响NF-κB信号通路相关蛋白p-IKB和p-P65的表达抑制OGD/R诱导的心肌细胞凋亡(P<0.05)。使用NF-κB信号通路激动剂研究结果显示,激活NF-κB信号通路能够阻碍丹参酮通过调控巨噬细胞分化抑制OGD/R诱导的心肌细胞凋亡过程。结论丹参酮通过调控巨噬细胞分化,影响NF-κB信号通路,进而抑制OGD/R诱导的心肌细胞凋亡。

青蒿琥酯调节PERK/ATF4/CHOP信号通路对OGD/R诱导的心肌细胞铁死亡的影响

目的:探讨青蒿琥酯调节蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/激活转录因子-4(ATF4)/C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的心肌细胞铁死亡的影响。方法:体外培养大鼠心肌细胞H9c2构建OGD/R模型,通过CCK-8法检测0、1.0、2.5、5、10、20μmol/L青蒿琥酯处理24h后各组细胞活力,筛选合适的青蒿琥酯作用浓度。将体外培养H9c2细胞随机分为对照组、模型组、青蒿琥酯低剂量组、青蒿琥酯高剂量组、MK-28(PERK激活剂)组、青蒿琥酯高剂量+MK-28组,除对照组外的其余各组细胞构建OGD/R模型,然后马上使用青蒿琥酯和MK-28分组处理,采用CCK-8法和流式细胞术分别检测各组H9c2细胞活力和凋亡率;ELISA检测各组H9c2细胞培养基上清中心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌红蛋白(MB)、炎性因子[前列腺素E2(PGE2)、环氧化酶-2(COX-2)、白细胞介素(IL)-1β]水平;化学荧光法检测活性氧(ROS)水平,微量法检测铁含量、丙二醛(MDA)水平,微板法检测谷胱甘肽(GSH)水平;免疫印迹实验检测各组H9c2细胞PERK/ATF4/CHOP通路相关蛋白表达。结果:与对照组比较,模型组细胞活力、GSH水平降低(P<0.05),凋亡率、细胞培养基上清中cTnI、CK-MB、MB、PGE2、COX-2及IL-1β水平、细胞ROS相对水平、铁含量、MDA水平、p-PERK/PERK及ATF4、CHOP蛋白表达升高(P<0.05)。与模型组比较,青蒿琥酯低剂量组、青蒿琥酯高剂量组细胞活力、GSH水平均升高(P<0.05),凋亡率、细胞培养基上清中cTnI、CK-MB、MB、PGE2、COX-2及IL-1β水平、细胞ROS相对水平、铁含量、MDA水平、p-PERK/PERK及ATF4、CHOP蛋白表达均降低(P<0.05);青蒿琥酯高剂量组细胞活力、GSH水平相较青蒿琥酯低剂量组进一步升高(P<0.05),凋亡率、细胞培养基上清中cTnI、CK-MB、MB、PGE2、COX-2及IL-1β水平、细胞ROS相对水平、铁含量、MDA水平、p-PERK/PERK及ATF4、CHOP蛋白表达较青蒿琥酯低剂量组进一步降低(P<0.05);MK-28组细胞活力、GSH水平降低(P<0.05),凋亡率、细胞培养基上清中cTnI、CK-MB、MB、PGE2、COX-2及IL-1β水平、细胞ROS相对水平、铁含量、MDA水平、p-PERK/PERK及ATF4、CHOP蛋白表达升高(P<0.05)。与青蒿琥酯高剂量组比较,青蒿琥酯高剂量+MK-28组细胞活力、GSH水平降低(P<0.05),凋亡率、细胞培养基上清中cTnI、CK-MB、MB、PGE2、COX-2及IL-1β水平、细胞ROS相对水平、铁含量、MDA水平、p-PERK/PERK及ATF4、CHOP蛋白表达升高(P<0.05)。结论:青蒿琥酯可通过抑制PERK/ATF4/CHOP信号激活而抑制OGD/R诱导的心肌细胞炎症、铁蓄积和脂质过氧化,减轻铁死亡,增强其细胞活力,缓解细胞损伤。

TERT沉默对OGD/R诱导的大鼠体外星形胶质细胞损伤的影响及机制

目的:探讨端粒酶逆转录酶(TERT)沉默对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)诱导的大鼠体外星形胶质细胞损伤的影响及机制。方法:体外原代培养新生大鼠脑皮层星形胶质细胞,建立星形胶质细胞OGD/R损伤模型。将细胞分为正常对照(Control)组、糖氧剥夺6 h/复糖复氧24 h(OGD/R)组、OGD/R+转染阴性对照(OGD/R+Si-Con)组及OGD/R+干扰TERT表达的SiRNA(OGD/R+Si-TERT)组。免疫荧光检测TERT及GFAP在星形胶质细胞的定位及表达变化。TERT-SiRNA转染后48 h收集细胞,通过Western blotting检测TERT的表达以验证转染效率。采用CCK-8法检测各组细胞的活力,Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡情况,Western blotting检测p53、Bax和Bcl-2蛋白的表达水平。结果:免疫荧光结果显示,TERT可表达于星形胶质细胞,以胞核为主,胞质表达较少。与OGD/R+Si-Con组比较,转染TERT-siRNA的星形胶质细胞中TERT表达降低(P<0.05),表明TERT-SiRNA转染星形胶质细胞成功;与Control组比较,OGD/R组、OGD/R+Si-Con组及OGD/R+Si-TERT组细胞活力及Bcl-2蛋白表达均降低,细胞凋亡率及TERT、P53和Bax蛋白表达均升高(均P<0.05);与OGD/R+Si-Con组比较,OGD/R+Si-TERT组细胞凋亡率及P53、Bax蛋白表达升高,细胞活力及TERT、Bcl-2蛋白表达降低(均P<0.05)。结论:TERT基因沉默促进OGD/R诱导的大鼠星形胶质细胞凋亡,其机制可能与激活P53/Bcl-2/Bax信号通路有关。

miR-22-3p靶向调控PLAGL2保护OGD/R诱导的心肌细胞损伤机制研究

目的探讨miR-22-3p在氧-糖剥夺/复氧(OGD/R)心肌细胞铁死亡中的作用及机制。方法大鼠心肌细胞系H9c2采用OGD/R处理以及转染miR-22-3p模拟物(miR-22-3p mimic)。细胞根据是否缺氧及有无转染分为常氧组、OGD/R组、OGD/R+miRNA模拟物阴性对照(miRNA-NC组)和OGD/R+miR-22-3p组。采用细胞计数(CCK-8)法检测细胞活力,酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测H9c2细胞中铁死亡指标水平,Western blot检测谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)及多形性腺瘤基因样蛋白2(PLAGL2)蛋白表达,双荧光素酶报告实验验证miR-22-3p和PLAGL2靶向关系。结果OGD/R处理H9c2细胞后,第4天的吸光度值低于常氧组,活性氧(ROS)及丙二醛(MDA)水平、Fe^(2+)的积累明显高于常氧组,miR-22-3p水平明显低于常氧组(t分别=3.78、4.24、2.54、4.47、3.53,P均<0.05),H9c2细胞转染miR-22-3p mimic及OGD/R处理后,第3、4天的吸光度值高于miR-NC+OGD/R组(t分别=2.98、1.97、2.57、2.46,P均<0.05),细胞MDA、ROS、Fe^(2+)明显低于OGD/R+miR-NC组(t分别=2.62、5.35、4.11,P均<0.05),Gpx4表达水平高于OGD/R+miR-NC组。Fer-1和OGD/R处理H9c2细胞后,第3、4天的细胞吸光度值明显高于OGD/R组(t分别=3.12、3.36,P均<0.05),细胞MDA、ROS和Fe^(2+)水平显著低于OGD/R组(t分别=3.03、5.33、2.48,P均<0.05)。H9c2细胞转染miR-22-3p组的PLAGL2蛋白表达明显低于miR-NC组,且PLAGL2-WT+miR-22-3p组的荧光素酶活性明显低于PLAGL2-MUT+miR-22-3p组(t=2.69,P<0.05)。H9c2细胞共转染miR-22-3p mimic和PLAGL2过表达质粒后,Gpx4表达低于OGD/R+miR-22-3p组,吸光度值明显低于OGD/R+miR-22-3p组(t分别=3.91、3.12,P均<0.05),MDA、Fe^(2+)、ROS水平高于OGD/R+miR-22-3p组(t分别=3.78、3.87、3.05,P均<0.05)。结论miR-22-3p靶向调控PLAGL2表达抑制铁死亡,进而降低OGD/R诱导的心肌细胞损伤。

丹灯通脑胶囊含药脑脊液对OGD/R损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用

目的研究丹灯通脑胶囊含药脑脊液对缺糖缺氧再复糖复氧(OGD/R)损伤大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)的保护作用。方法 SD大鼠每日灌胃给予丹灯通脑胶囊(490 mg/kg)2次,连续4 d,以制备含药脑脊液,原代培养大鼠BMECs,并对其进行Ⅷ因子相关抗原免疫荧光鉴定。然后,利用倒置显微镜观察BMECs形态,CCK-8法观察细胞活力,通过测定跨内皮细胞电阻(TEER)来评价BMECs通透性变化,取细胞上清检测BMECs总一氧化氮(NO)和内皮素1(ET-1)水平,以及BMECs组织型纤溶酶原激物(t PA)、纤溶酶原激活剂抑制物1(PAI-1)水平。结果含药脑脊液可显著对抗OGD/R所造成的损伤,明显改善BMECs形态。与模型组比较,含药脑脊液组细胞活力显著升高,TEER值显著增加,细胞通透性降低,细胞培养上清液中总NO、t PA水平明显增加,ET-1、PAI-1是水平显著降低。结论丹灯通脑胶囊含药脑脊液对OGD/R损伤大鼠BMECs具有保护作用。

δ-联蛋白通过AKT信号通路调控OGD/R后的炎症反应

联蛋白(delta-catenin)作为高表达于神经系统的黏附蛋白质,在神经系统的功能发挥中有着至关重要的作用,但其在缺血缺氧性脑病中的研究尚未见报道。本文通过体外培养原代皮层神经元,构建氧糖剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型。用Western印迹、LDH等方法显示,与对照组相比,δ-联蛋白在OGD/R模型后的不同时间点(0、4、12、24和48 h)表达呈先降低后升高的趋势。在12 h表达量最低(0. 48±0. 08 vs 1. 53±0. 18,P<0. 05),在48 h表达升高到对照组水平(1. 35±0. 15 vs 1. 53±0. 18,P>0. 05)。用siRNA慢病毒干扰δ-联蛋白表达后,ELISA结果显示,和对照组相比,OGD/R后,IL-1β和IL-18升高(24. 80±1. 64 vs 12. 75±0. 87,28. 12±2. 69 vs 12. 99±1. 24,P<0. 05),但在干扰δ-联蛋白表达后,和OGD组相比,IL-1β和IL-18释放降低(12. 81±0. 78 vs 24. 80±1. 64,14. 27±1. 37 vs 28. 12±2. 69,P<0. 05)。Western印迹结果显示,AKT信号通路磷酸化位点Ser 473活化增高(1. 08±0. 04 vs 0. 85±0. 06,P<0. 05),但Thr 308位点活化无改变(1. 17±0. 06 vs 1. 11±0. 08,P>0. 05)。在siRNA慢病毒干扰并且联合使用AKT信号通路抑制剂GSK 690693后,和OGD+siRNA组相比,IL-1β和IL-18释放增高(24. 58±0. 99 vs 12. 81±0. 78,31. 62±2. 23 vs 14. 27±1. 37,P <0. 05)。上述结果显示,δ-联蛋白通过AKT信号通路调控OGD/R后的炎症反应,这可作为δ-联蛋白功能研究的新的实验依据。

肌肽通过激活Nrf2/ARE信号通路改善OGD/R诱导星形胶质细胞损伤

目的探讨肌肽对缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)引起星形胶质细胞(astrocyte,AS)损伤的保护作用,并阐明其机制。方法分离新生24 h SD大鼠大脑皮质,培养并纯化AS后,随机分为对照组、模型组、OGD/R+肌肽组(1、3、9 mmol/L)。倒置显微镜观察细胞形态;免疫荧光GFAP染色法测定细胞纯度;噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率;比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率;Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡;流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)含量;免疫荧光检测Phospho-Nrf2(S40)的入核水平;Western blotting法检测Nrf2总蛋白以及Phospho-Nrf2(S40)蛋白表达;qPCR法检测HO-1、NQO1 mRNA含量。结果与对照组相比,模型组细胞活力明显降低(P<0.01),LDH漏出及细胞凋亡率显著增加(P<0.01),细胞内ROS生成明显增加(P<0.01),AS核内Phospho-Nrf2(S40)含量及其下游产物HO-1、NQO1 mRNA表达量下调(P<0.01)。与模型组相比,OGD/R+肌肽组(1、3、9 mmol/L)细胞活力明显升高(P<0.01),LDH漏出及细胞凋亡率降低(P<0.01),细胞内ROS生成不同程度减低(P<0.01),AS核内Phospho-Nrf2(S40)含量及其下游产物HO-1、NQO1 mRNA表达量上调(P<0.01)。结论肌肽可通过抑制OGD/R诱导ROS释放,激活Nrf2-ARE通路,进而增强其下游抗氧化酶HO-1、NQO1 mRNA的表达,对AS发挥保护作用。

萝卜硫素通过Keap1/Nrf2通路缓解OGD/R诱导的星形胶质细胞氧化应激

目的:研究萝卜硫素(SFA)对糖氧剥夺/再灌注(OGD/R)大鼠星形胶质细胞氧化应激的影响。方法:将新生大鼠脑组织中分离培养的星形胶质细胞分为3组,分别是对照组(control)、OGD/R处理组、OGD/R和SFA联合处理组(OGD/R+SFA),利用低氧培养箱及无糖DMEM培养基制备OGD/R细胞模型,OGD/R+SFA组细胞在制备OGD/R的同时给予终浓度为50μmol/L的SFA处理,用商品化试剂盒分别检测细胞活性和丙二醛(MDA)的含量,利用Western Blot检测大鼠细胞中核因子E2相关因子2(Nrf2)的核转位及血红素加氧酶-1(HO-1)和醌氧化还原酶1(NQO1)的表达。结果:SFA能够显著增加OGD/R诱导的星形胶质细胞活力(P<0.05),减少MDA的含量,同时促进Nrf2转位到细胞核并促进靶分子HO-1和NQO1表达(P<0.05)。结论:SFA通过激活星形胶质细胞中Keap1/Nrf2信号通路减轻OGD/R诱导的细胞损伤。

人参皂苷Rg_(1)通过IRE1-JNK-CHOP通路抑制自噬改善OGD/R诱导的PC12细胞损伤

探讨人参皂苷Rg_(1)(ginsenoside Rg_(1),GRg_(1))对氧糖剥夺/复氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤大鼠嗜铬细胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma,PC12)细胞的保护作用及其作用机制是否与调控肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)-c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)-C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)信号通路有关。在PC12细胞中建立OGD/R模型,将PC12细胞随机分组为对照组、模型组、OGD/R+GRg_(1)(0.1、1、10μmol·L^(-1))组,OGD/R+GRg_(1)+雷帕霉素(rapamycin,自噬激动剂)组、OGD/R+GRg_(1)+3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA,自噬抑制剂)组、OGD/R+GRg_(1)+衣霉素(tunicamycin,内质网应激激动剂)组、OGD/R+GRg_(1)+4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA,内质网应激抑制剂)组、OGD/R+GRg_(1)+3,5-二溴水杨醛(3,5-dibromosalicylaldehyde,DBSA,IRE1抑制剂)组。除对照组外,其他组都进行OGD/R处理,即氧糖剥夺6 h再复氧6 h。MTT法检测细胞活力,Hoechst 33342染色检测细胞凋亡情况,MDC法检测细胞自噬体的荧光强度。Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、p62和通路相关蛋白IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、CHOP的表达情况。结果显示,与模型组相比,0.1、1、10μmol·L^(-1)GRg_(1)剂量依赖性地提高了PC12细胞的活力,降低了自噬蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ和通路相关蛋白p-IRE1、p-JNK、GRP78、CHOP表达,降低了细胞凋亡率和MDC荧光强度,同时也增加了p62蛋白表达。而分别干预自噬和内质网应激后,与OGD/R+GRg_(1)(10μmol·L^(-1))组相比,OGD/R+GRg_(1)+rapamycin组和OGD/R+GRg_(1)+tunicamycin组细胞凋亡率和MDC荧光强度增加,自噬蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ和通路相关蛋白p-IRE1、p-JNK、GRP78、CHOP表达增加,细胞相对存活率和p62蛋白表达降低。3-MA、4-PBA和DBSA则发挥了相反作用。综上所述,GRg_(1)可能通过IRE1-JNK-CHOP通路抑制自噬而改善OGD/R诱导PC12细胞的损伤。

清脑滴丸通过调节LncRNA MEG3和NLRP3炎症小体对大鼠脑微血管内皮细胞OGD/R损伤的影响

目的:观察清脑滴丸对大鼠脑微血管内皮细胞(rat brain microvascular endothelial cells,RBMECs)氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤模型的影响,探讨其调节长链非编码RNA母系表达基因3(long non-coding RNA maternally expressed gene 3,LncRNA MEG3)表达及对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体活化的作用。方法:将20只SD大鼠随机分为空白血清组和清脑滴丸含药血清组(150 mg·kg^(-1)),每组10只,连续灌胃7 d,每日2次,从而制备血清样品。取对数生长期的RBMECs,随机分为对照组、模型组、清脑滴丸组、MEG3过表达组、MEG3过表达+清脑滴丸组。除对照组外,其余各组细胞均进行OGD/R造模。观察细胞血管形成情况,采用CCK-8法检测细胞存活率,qRT-PCR法检测细胞LncRNA MEG3 mRNA表达水平,Western blot法检测细胞NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-1,c-Caspase-1)、肿瘤抑制蛋白p53(tumor suppressor protein p53,p53)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3,c-Caspase-3)表达水平。结果:与对照组比较,模型组细胞存活率降低、RBMECs形成的血管总长度缩短(P<0.01);与模型组比较,清脑滴丸组、MEG3过表达+清脑滴丸组细胞存活率升高、RBMECs形成的血管总长度增加(P<0.05)。与对照组比较,模型组LncRNA MEG3 mRNA水平升高(P<0.05);与模型组比较,清脑滴丸组LncRNA MEG3 mRNA水平降低(P<0.01),MEG3过表达+清脑滴丸组、MEG3过表达组LncRNA MEG3 mRNA水平升高(P<0.01);与清脑滴丸组比较,MEG3过表达+清脑滴丸组细胞LncRNA MEG3 mRNA水平升高(P<0.01)。与对照组比较,模型组细胞NLRP3、ASC、c-Caspase-1、p53、c-Caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.01);与模型组比较,清脑滴丸组、MEG3过表达+清脑滴丸组细胞NLRP3、ASC、c-Caspase-1、p53、c-Caspase-3蛋白表达水平降低(P<0.05);与清脑滴丸组比较,MEG3过表达+清脑滴丸组细胞NLRP3、ASC、c-Caspase-1、p53蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:清脑滴丸可能通过下调LncRNA MEG3表达和抑制NLRP3炎症小体活化,提高细胞存活率和血管形成能力,从而发挥对RBMECs的保护作用。

水苏碱调节PI3K/Akt/NF-κB信号通路对OGD/R诱导的神经元焦亡的影响

目的探讨水苏碱(Stachydine,STA)对氧糖剥夺再灌注(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)诱导的神经元焦亡及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/核转录因子-κB(Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/nuclear transciption factor-kappa B,PI3K/Akt/NF-κB)信号通路的影响机制。方法MTT比色(MTT assay kit,MTT)法检测不同水平STA对海马神经元细胞系Ht22细胞活力的影响;将Ht22细胞进行OGD/R诱导后分为模型组(OGD/R组)、水苏碱低剂量组(STA-L组)、水苏碱中剂量组(STA-M组)、水苏碱高剂量组(STA-H组)、水苏碱高剂量+通路激活剂740Y-P组(STA-H+740Y-P组)、通路激活剂740Y-P组(740Y-P组),另设置正常培养的细胞为对照组(Control组);细胞活性检测试剂(Cell counting kit-8,CCK-8)法检测Ht22细胞增殖活性;Hoechst/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色法检测细胞膜损伤;流式细胞仪检测细胞焦亡;酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测白细胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-18和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平;吸光光度法检测细胞内超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平;2,7-二氯荧光素二乙酸酯(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)荧光染色检测细胞活性氧(Reactive oxygenspecies,ROS)水平;Western blot检测焦亡相关蛋白裂解半胱氨酸蛋白酶-1(Cleaved-caspase-1,C-Caspase-1)、消皮素D(Gasdermin D,GSDMD)和GSDMD-N和PI3K/Akt/NF-κB信号通路蛋白表达水平。结果STA水平在0.5μmol/L以下不影响Ht22细胞活力,因此采用0.1、0.2、0.5μmol/L STA进行后续实验。与Control组比较,OGD/R组Ht22细胞增殖活性(24、48、72 h)、SOD活性显著降低,红色荧光强度、焦亡率、焦亡蛋白C-Caspase-1,GSDMD和GSDMD-N、炎性因子、MDA,ROS及PI3K/Akt/NF-κB信号通路蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与OGD/R组比较,STA-L,STA-M,STA-H组Ht22细胞增殖活性、SOD活性显著上升,红色荧光强度、焦亡率、焦亡蛋白C-Caspase-1,GSDMD和GSDMD-N、炎性因子、MDA、ROS及PI3K/Akt/NF-κB信号通路蛋白表达水平显著降低(P<0.05);STA-H+740Y-P组与OGD/R组上述指标水平无显著差异(P>0.05);740Y-P组与OGD/R组比较,病理程度显著加重(P<0.05),通路激活剂740Y-P可抵消STA对于神经细胞损伤的保护作用。结论STA可以通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路来减轻OGD/R诱导的Ht22细胞焦亡。

丹酚酸A对OGD/R诱导脑微血管内皮细胞凋亡和氧化应激损伤的作用及机制

目的研究丹酚酸A(salvianolic acid A,SAL-A)对氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)诱导脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,b.End.3)凋亡和氧化应激损伤的作用及机制。方法应用b.End.3细胞OGD/R损伤模型评价SAL-A对OGD/R诱导b.End.3细胞凋亡和氧化应激的作用及机制。膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素探针(Annexin V-fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC)以及碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色检测细胞凋亡;2,7-二氯荧光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)探针检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成;JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位;以免疫印迹法检测细胞凋亡、氧化应激及蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)/核转录因子E2相关因子(nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2)通路相关蛋白的表达。结果与正常对照组比较,OGD/R组抗凋亡蛋白表达、线粒体膜电位水平、相关抗氧化蛋白表达、Akt/GSK3β/Nrf2通路表达均显著降低(P<0.05),而细胞凋亡数、凋亡诱导蛋白表达、细胞内ROS产生均显著增高(P<0.05);而SAL-A处理后可改善OGD/R诱导的细胞凋亡和氧化应激,Akt/GSK3β/Nrf2通路蛋白表达显著增高。结论SAL-A能够抑制OGD/R所诱导的脑微血管内皮细胞凋亡与氧化应激损伤,机制与调控Akt/GSK3β/Nrf2通路相关。