OGD模型乳小鼠的星状胶质细胞内miR-31对共培养神经元氧化应激损伤的影响

目的探究氧-糖剥夺(OGD)模型乳小鼠的星状胶质细胞内miR-31调控PKD1基因表达,进而抑制JAK-STAT3信号通路活化介导的OGD共培养神经元炎症反应以及氧化应激损伤的保护机制.方法提取乳小鼠原代星状胶质细胞和神经元,流式细胞仪分选纯化,之后将星状胶质细胞分别转染miR-31 mimic、miR-31 inhibitor、si-PKD1或加入JAK-STAT3通路抑制剂;构建OGD模型将转染后的星状胶质细胞与神经元共培养,并分为七组:normal组,blank OGD组,NC OGD组,miR-31 mimic OGD组,miR-31 inhibitor OGD组,si-PKD1 OGD组,si-PKD1+CdCl_(2)OGD组.MTT法检测OGD共培养体系中神经元存活率;LDH漏出率测定OGD共培养体系中神经元细胞损伤;TUNEL法检测OGD共培养体系中神经元凋亡;免疫荧光法检测OGD共培养体系中氧化应激损伤相关蛋白4-HNE和8-OHdG表达;TBA法检测OGD共培养体系中MDA含量;黄嘌呤氧化酶法检测OGD共培养体系中SOD含量;ELISA检测OGD共培养体系中炎症因子;qRT-PCR检测OGD共培养体系中miR-31和PKD1的表达;Western blot检测OGD共培养体系中PKD1及JAK-STAT3通路相关蛋白表达.结果OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控炎症反应结果显示:与blank组和NC组相比,miR-31 mimic组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量显著降低(均P<0.05),miR-31 inhibitor组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量显著上升(均P<0.05).与blank组和NC组相比,miR-31 mimic组神经元存活率上升,LDH漏出率、ROS表达量显著降低(均P<0.05),miR-31 inhibitor组神经元存活率显著降低,LDH漏出率和ROS表达量显著升高(均P<0.05);OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控对神经元的活性的影响结果显示:与单独培养(Neuron组)相比,共培养条件下神经元(Neuron+astrocytes)的增殖及存活率、LDH表达及凋亡率差异均无统计学意义(均P>0.05);与神经元组(Neuron组)相比,神经元OGD模型组(Neuron OGD组)细胞增殖及存活率减少,培养液中LDH表达增加,细胞凋亡率增加(均P<0.05);与神经元OGD模型(Neuron OGD组)相比,神经元+星状胶质细胞OGD组(Neuron+astrocytes OGD)细胞存活率减少,培养液中LDH表达增加,细胞凋亡率增加(均P<0.05);OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控PKD1各组细胞中mRNA、蛋白表达水平及炎症因子表达结果显示:相比于normal组,blank OGD组的星状胶质细胞中miR-31的表达量下降(P<0.05),而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著上升(P<0.05),炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量上调(P<0.05);相比于blank OGD组,miR-31 mimic OGD组星状胶质细胞中miR-31的表达量上调(P<0.05),而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著降低(P<0.05),炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量下调(P<0.05);miR-31 inhibitor OGD组miR-31的表达量下降(P<0.05),而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著上升(均P<0.05),炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量上调(P<0.05);si-PKD1 OGD组和si-PKD1+CdCl_(2)OGD组miR-31的表达量无显著变化(P>0.05),而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著降低(均P<0.05),炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量下调(P<0.05);NC OGD组各指标差异无统计学意义(均P>0.05);OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控PKD1基因抑制OGD导致的神经元氧化应激损伤结果显示:相比于normal组,blank OGD组LDH和MDA表达量上升,SOD表达下降,神经元膜脂质过氧化损伤标志蛋白4-HNE和DNA氧化损伤标志蛋白8-OHdG免疫染色强度增强,神经元存活率降低,神经元出现氧化应激损伤(均P<0.05);与blank OGD组相比,miR-31 inhibitor OGD组LDH漏出量和MDA表达量上升,SOD表达下降,神经元膜脂质过氧化损伤标志蛋白4-HNE和DNA氧化损伤标志蛋白8-OHdG免疫染色强度增强,神经元存活率降低,细胞凋亡率上升,神经元氧化应激损伤加重(均P<0.05);miR-31 mimic OGD组、si-PKD1 OGD组和si-PKD1+CdCl_(2)OGD组LDH漏出量和MDA表达量下降,SOD表达上升,神经元膜脂质过氧化损伤标志蛋白4-HNE和DNA氧化损伤标志蛋白8-OHdG免疫染色强度降低,神经元存活率增加,细胞凋亡率下降,神经元氧化应激损伤减缓(均P<0.05);NC OGD组各指标差异无统计学意义(均P>0.05);采用TUNEL染色及Western blot检测OGD共培养体系中神经元凋亡结果显示:相比于normal组,blank OGD组神经元细胞凋亡率及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax表达显著增加(均P<0.05);与blank OGD组相比,miR-31 inhibitor OGD组神经元细胞凋亡率及cleaved caspase-3、Bax表达明显上升(均P<0.05);miR-31 mimic OGD组、si-PKD1 OGD组和si-PKD1+CdCl_(2)OGD组神经元细胞凋亡率及cleaved caspase-3、Bax表达明显下调(均P<0.05);NC OGD组各cleaved caspase-3、Bax表达差异无统计学意义(均P>0.05).结论OGD模型乳小鼠星状胶质细胞内miR-31靶向下调PKD1基因,进而通过抑制JAK/STAT3信号通路降低炎症反应,从而减轻OGD神经元氧化应激损伤.