空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的B细胞抗原表位分析及功能鉴定

目的从生物信息学角度了解空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的跨膜结构、B细胞抗原表位及其抗原性、基因序列保守性等特征,并鉴定空肠弯曲菌主要外膜蛋白优势B细胞抗原表位,为后续抗体检测和疫苗研究提供实验依据。方法使用NCBI/Blast,TMHMM Server V2.0,DNA Star等生物信息学分析软件对空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18进行蛋白跨膜结构预测、线性B细胞抗原表位及其抗原性分析、并对不同空肠弯曲菌OMP18蛋白的氨基酸序列同源性进行比较。采用空肠弯曲菌全菌抗体IgG为一抗,基于ELISA技术对优势线性B细胞抗原表位进行筛选鉴定。结果生物信息学预测结果表明外膜蛋白OMP18定位于空肠弯曲菌外膜且不存在跨膜结构。蛋白序列保守存在于各空肠弯曲菌株中,序列同源性达95%以上。同时,我们发现该外膜蛋白中存在3个明显的B细胞线性表位,且具有很强的抗原性。ELISA检测鉴定结果表明3个B细胞抗原表位都能有效识别空肠弯曲菌全菌抗体。结论空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18保守存在于细菌表面,存在3个重要的B细胞线性抗原表位,可用于后续的抗体检测和疫苗开发研究。

基于OMP18的B细胞抗原表位的空肠弯曲菌ELISA检测方法的建立

目的以OMP18的B细胞抗原表位多肽为包被抗原,建立检测空肠弯曲菌感染的ELISA方法。方法以不同浓度梯度(0.1,1,10μg/mL)OMP18的B细胞抗原表位多肽进行包被,以空肠弯曲菌全菌兔抗IgG为一抗,HRP标记的羊抗兔抗体IgG为二抗,检测对原浓度1mg/mL的不同稀释度(1∶10,1∶100,1∶1 000)抗体IgG水平。分别以空肠弯曲菌感染兔血清、健康兔血清及沙门菌感染兔血清为一抗,1∶3 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG为二抗,比较各抗原表位多肽的免疫特异性。结果 OMP18的B细胞抗原3个表位多肽在稀释度在1∶1 000、1∶4 000、1∶16 000、1∶64 000时免疫反应性均有明显增高。其中稀释度在1∶1 000时增高最明显。OMP18的B细胞抗原表位多肽具有免疫特异性。结论用OMP18的B细胞抗原表位多肽作为包被抗原对空肠弯曲菌感染的血清进行ELISA检测,免疫反应性高,具有免疫特异性。

幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18免疫优势表位的预测与鉴定

目的:分析预测幽门螺杆菌(Hp)外膜蛋白Omp18的免疫优势表位,并进一步验证确定其免疫优势片段的免疫原性。方法:通过生物信息学软件DNAStar分析预测幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18的潜在优势表位,并由北京赛百盛基因技术有限公司合成相应的优势片段;片段通过口服免疫的方式免疫接种雌性BALB/c小鼠,每周1次共免疫4次。末次免疫10 d后处死小鼠,取血清检测IgG、IgA水平,取肠道灌洗液检测sIgA水平;取小鼠脾细胞ELISA法检测细胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6水平,并通过MTT比色法检测脾细胞增殖情况;末次免疫10 d后Hp标准株攻击小鼠2次,4周后处死小鼠,取胃组织进行快速尿素酶实验,并计算每组的感染率。结果:ELISA法检测各片段免疫小鼠血清IgG、IgA以及肠道sIgA水平均高于对照组,且差异有显著统计学意义(P<0. 05);各免疫组脾细胞上清INF-γ、IL-2水平均显著高于对照组(P<0. 05),而IL-4、IL-6水平较对照组则差异无显著统计学意义(P>0. 05);MTT比色法结果显示各片段刺激后小鼠淋巴细胞均有显著增殖(P<0. 05);快速尿素酶实验结果提示各片段免疫后均能显著减少小鼠胃组织中Hp的感染(P<0. 05)。结论:通过生物信息学软件分析预测的外膜蛋白Omp18优势片段均具有较好的免疫原性,且对Hp感染有一定的保护作用。

幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18表达载体构建及其多克隆抗体的制备

目的制备幽门螺杆菌的外膜蛋白Omp18及其多克隆抗体。方法设计Omp18基因引物,PCR扩增Omp18基因,将其连入pMD-18T载体,再克隆入原核表达载体pTriEx(TM)-4,重组质粒转化大肠埃希菌JM109DE,IPTG诱导表达Omp18蛋白,纯化后免疫家兔,以获得多克隆抗体。结果 PCR扩增的Omp18基因成功克隆入原核表达载体,重组原核表达载体转化菌表达Omp18蛋白,纯化的Omp18蛋白免疫动物后血清中获得多克隆抗体。结论本实验成功进行了Omp18蛋白的原核细胞表达并制备了多克隆抗体,为研究Omp18的功能、表达调控以及幽门螺杆菌检测和疫苗生产等奠定了基础。

幽门螺杆菌外膜蛋白18的克隆表达及纯化研究

目的克隆表达幽门螺杆菌(HP)外膜蛋白,为HP的疫苗开发及诊断试剂盒的研究奠定基础。方法用PCR方法从HP临床分离株9806的染色体DNA中扩增出OMP18基因片段,将目的基因插入表达载体pQE30中,重组载体pQE30-OMP18经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E.coli.M15,IPTG诱导表达。采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定其表达。结果PCR扩增出长度为537bp的OMP18基因,片段测序分析其与Gen-Bank公布的核苷酸序列相似性达99%;SDS-PAGE显示,重组工程菌经IPTG诱导表达了分子量为20.0kDa的目的蛋白,占总蛋白的20%,经纯化后,目的蛋白纯度达85%以上;Western blot结果表明,该蛋白可与兔抗HP的多克隆抗血清发生特异的抗原抗体结合反应。结论成功构建了OMP18表达载体pQE30-OMP18,并在大肠杆菌中获得高效表达,为HP疫苗有效抗原筛选及诊断试剂的开发奠定基础。