副猪嗜血杆菌OMP5抗原免疫刺激复合物的制备及其对小鼠免疫功能的影响

为探究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)外膜蛋白(outer membrane prtein,OMP)免疫刺激复合物(immune stimulating complexs,ISCOM)的抗原性,试验采用PCR方法扩增HPS的OMP5基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,获得重组表达质粒pET-28a-OMP5;进一步以QuilA、胆固醇和磷脂酰胆碱为原料,用透析法制备HPS OMP5抗原免疫刺激复合物(ISCOM-OMP5),用其免疫ICR小鼠后检测HPS抗体水平、细胞因子基因相对表达量及淋巴细胞增殖情况,以评价ISCOM-OMP5的免疫增强效果。结果表明:构建的重组表达质粒能够成功表达目的蛋白,大小约为40 ku;制备的ISCOM-OMP5具有ISCOM的典型蜂窝状结构,直径为30~40 nm,ISCOM-OMP5蛋白的包封率达85.8%;用ISCOM-OMP5对小鼠进行免疫,二免后14天即可在小鼠血清中检测到较高水平HPS抗体;ISCOM-OMP5能极显著提高白细胞介素-10(IL-10)和γ干扰素(IFN-γ)基因的相对表达量(P<0.01),显著提高T淋巴细胞的增殖能力(P<0.05),极显著提高B淋巴细胞的增殖能力(P<0.01)。说明ISCOM-OMP5可有效诱导小鼠产生针对HPS的免疫应答,能显著增强免疫效果。

广东与四川地区发病猪副猪嗜血杆菌分离株omp5基因的克隆及序列分析

为了比较副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白P5(omp5)基因的同源性及抗原性,试验设计合成1对特异性引物,通过PCR方法从广东省和四川省发病猪的30株分离菌中扩增出HPS omp5基因,然后将PCR产物克隆至pMDTM18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,并进行序列测定与分析。结果表明:30株HPS omp5基因的完整序列有3种长度,分别为1 116 bp、1 104 bp、1 098 bp;与已发表的血清5型HPS SH0165的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列比较,广东分离菌株核苷酸同源性为90.5%～100%,氨基酸同源性为88.8%～100%;而四川分离菌株的核苷酸序列同源性为90.8%～94.1%,氨基酸同源性为89.9%c93.0%;进化树分析显示,HPS omp5基因无论是在不同血清型之间还是不同地区之间都具有较高的同源性,说明OMP5蛋白比较保守,有望作为型间共用性抗原。

副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆及生物信息学分析

根据GenBank上公布的副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5基因的核苷酸序列，设计1对特异性引物，对贵州省HPS分离株OMP5基因进行扩增。结果表明所扩增的OIvIP5基因的长度为1116bp，与SH0165株对应的核苷酸序列和氨基酸同源性均为lOO％。生物信息学分析结果表明，OMP5基因所编码的外膜蛋白P5的理论等电点pl为9．34不稳定系数为20．44，推测其为稳定性蛋白；脂肪指数为83．94，总体平均亲水性为-0．172，推测该蛋白是一种亲水性蛋白；该蛋白含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲，无跨膜区，最前端的21个N-末端氨基酸残基为信号肽序列并且主要为疏水性氨基酸，最佳切割位点在第21～22个氨基酸之间；结构位点预测表明该蛋白含有多个不同的糖基化和磷酸化位点。

副猪嗜血杆菌OMP5单克隆抗体的制备与鉴定

用副猪嗜血杆菌(HPS)血清5型灭活菌液免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,以HPS外膜蛋白5(OMP5)为抗原,经间接ELISA法筛选阳性融合孔,并用有限稀释法对筛选的阳性孔进行亚克隆,获得2株分泌抗HPS OMP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E2和8D9;间接ELISA法效价检测,1E2和8D9细胞培养上清抗体效价均为1∶2 560,纯化后腹水抗体效价分别为1∶204 800和1∶51 200;抗体型别鉴定,1E2和8D9分别分泌IgG2b、IgG2a型抗体;特异性检测表明,2株单抗均能特异识别OMP5。将2株杂交瘤细胞反复冻融3次复苏后仍能稳定分泌抗体。2株抗HPS OMP5单克隆抗体的成功制备,将为HPS感染快速检测方法的建立以及检测试剂的研制奠定基础。