rLTB/rCTB-rOmpL1/1融合基因及其原核表达系统的构建和鉴定

目的 :构建 lt B/ ct B- omp L1/ 1融合基因及其原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫和佐剂活性 ,检测问号钩端螺旋体 (简称钩体 )野生株 omp L 1基因的携带和表达情况及钩体患者血清特异性抗体水平。方法 :采用连接引物 PCR构建 lt B- omp L 1/ 1和 ct B- omp L 1/ 1融合基因 ,常规方法构建其原核表达系统。采用 SDS- PAGE、Westernblot和 GM1- ELISA分别检测目的重组蛋白 r LTB- r Omp L 1/ 1和 r CTB- r Omp L 1/ 1表达量、免疫反应性及与 GM1结合的活性。采用 PCR和 MAT分别检测 97株问号钩体野生株 omp L1基因及其表达情况。采用 ELISA检测 2 2 8例钩体患者血清 omp L1基因产物的抗体。结果 :与报道的相关序列比较 ,lt B- omp L1/ 1和 ct B- omp L1/ 1融合基因核苷酸和氨基酸序列相似性 ,分别为 99.7%～ 99.9%和 99.5 %～ 10 0 %。r LTB- r Omp L1/ 1和 r CTB- r Omp L1/ 1表达产量均约为细菌总蛋白的 10 % ,主要以包涵体形式存在。 r LTB- r Omp L 1/ 1和 r CTB- r Omp L1/ 1均分别能与r Omp L 1/ 1兔抗血清和牛 GM1结合。 89.7%问号钩体野生株含有 omp L1基因 ,87.6 %问号钩体野生株分别与r Omp L 1/ 1和 r Omp L1/ 2兔抗血清出现效价 ,为 1∶ 4～ 1∶ 2 5 6的 MAT阳性结果。 86 .8%和 88.6 %的患?

问号钩端螺旋体属lipL32/1-ompL1/1融合基因的真核表达及其表达产物的免疫反应性

目的 :构建问号钩端螺旋体 (简称钩体 )的融合基因 lip L32 / 1- omp L1/ 1真核表达系统并鉴定表达产物的免疫反应性。方法 :采用连接引物 PCR构建融合基因 lip L32 / 1- omp L1/ 1,克隆测序后构建 lip L32 / 1- omp L1/ 1的毕赤酵母真核表达系统 p PIC9K- lip L32 / 1- omp L1/ 1- P.pastoris GS115。用 MM和 MD平板分离 His+ Mut+型菌落 ,YPD平板筛选出 G4 18高抗性的 His+ Mut+ 转化子。以酵母裂解酶处理的高拷贝转化子 His+ Mut+ 克隆裂解产物为模板 ,5 'AOX1和 3'AOX1为引物 ,用 PCR检测所构建的毕赤酵母工程菌株染色体 DNA中的目的融合基因。在 BMMY培养基中用甲醇诱导目的重组蛋白 r L ip L32 / 1- r Omp L1/ 1表达。采用硫酸铵沉淀 ,Ni- NTA亲和层析提纯培养物上清液中的 r L ip L 32 / 1- r Omp L1/ 1。采用 SDS- PAGE和 Western blot分别检测 r L ip L 32 / 1- r Omp L 1/ 1的产量及其免疫反应性。结果 :获得的 lip L32 / 1- omp L1/ 1融合基因约为 1794 bp。其核苷酸和氨基酸序列与原始lip L32 / 1和 omp L1/ 1基因型比较 ,相似性分别高达 99.94 %和 10 0 %。所构建的真核表达系统可分泌 r Lip L32 / 1-r Omp L1/ 1,SDS- PAGE后位于预期位置处 ,产量约占上清总蛋白的 4 0 %。r Lip L32 /

问号钩端螺旋体lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因原核表达及其产物免疫原性分析

目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,优化目的产物表达条件并对表达产物免疫原性进行鉴定。方法:采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因,并用常规基因工程方法建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统,检测目的重组蛋白rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达量。采用免疫双扩散试验及WesternBlot,鉴定rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2的免疫原性。结果:获得了序列正确的lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统E.coliBL21DE-3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2。表达条件优化后的rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2产量为37.78mg/L,是优化前的3.7倍。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清免疫双扩效价为1∶4。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2抗血清能识别rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2以及rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2能与问号钩体56601株全菌兔抗血清以及黄疸出血群、流感伤寒群、波摩那群、秋季群问号钩体感染患者血清出现阳性杂交信号。结论:成功地构建了lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及通用型钩体病血清学检测的抗原。

两株问号钩端螺旋体OMPL1基因的分离与序列分析

用PCR方法获得了两株问号钩体赖型56601株和爪哇型56602株的OMPL1基因，并进行了全基因序列测定，测序结果与流感伤寒型RH52株的OMPL1基因进行了核苷酸序列比较和推导的氨基酸序列比较。赖型56601株和爪哇型56602株钩体OMPL1基因核苷酸序列与流感伤寒型RH52株的同源性分别为89％和80％，推导的外膜蛋白氨基酸序列的同源性分别为92％和88％。表明问号钩体赖型56601株和爪哇型56602株及流感伤寒型RH52株OMPL1基因的核苷酸序列存在较大差别，OMPL1基因在问号钩端螺旋体的基因分类中有一定作用。

犬型钩端螺旋体外膜蛋白OmpL1基因的克隆与序列分析

作者以犬型钩端螺旋体菌株的DNA为模板,采用PCR方法扩增目的基因OmpL1,克隆到pVAX1载体上,并对OmpL1基因测序后进行序列分析。结果获得960bp片段,DNA序列分析结果表明,该菌株的OmpL1基因与报道的七日热型、秋季型、波摩那型、澳洲型钩体的OmpL1基因核苷酸序列相似性分别为99.38%、93.77%、99.58%、99.38%,氨基酸序列相似性分别为100%、95%、100%、100%。证明OmpL1为致病性钩体所具有的保守性抗原成分,可在钩体病的预防和诊断中发挥重要作用。

问号钩端螺旋体属特异性OmpL1s抗原膜定位及其自然抗体应答

为了确定问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性OmpL1s抗原膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型,为OmpL1s用于研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒抗原提供依据。采用显微镜凝集试验(MAT)检测四川地区156份钩体病人血清标本。用PCR和核苷酸序列分析,了解中国流行的钩体主要血清群ompL1基因型。采用常规基因工程技术构建ompL1/1和ompL1/2主要基因型原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rOmpL1/1和rOmpL1/2。采用胶体金免疫电镜技术,对OmpL1s进行膜定位。建立了基于rOmpL1s的ELISAs,检测钩体病人血清中特异性抗体水平及其类型。试验结果表明,黄疸出血群钩体仍然是四川地区最主要的优势钩体血清群。中国流行的钩体主要血清群ompL1基因可有ompL1/1和ompL1/2两个基因型,两者核苷酸和氨基酸序列相似性之间有较明显的差异。OmpL1s是位于钩体外膜表面的蛋白分子。不同稀释度的156例钩体病人血清标本中,rOmpL1/1和rOmpL1/2特异性IgM阳性率分别为67.9%～79.5%和75.0%～75.6%,特异性IgG阳性率分别为71.8%～79.5%和75.0%～76.9%。上述试验结果提示,OmpL1s是位于钩体表面属特异性蛋白抗原。自然感染钩体时,rOmpL1/1和rOmpL1/2均可诱导机体体液免疫应答并产生IgM和IgG两类血清抗体,且两者之间有广泛的抗原交叉反应。rOmpL1/1和rOmpL1/2可作为研制通用性钩体基因工程疫苗和检测试剂盒的候选抗原。

海南地区某门诊泌尿生殖道沙眼衣原体的感染及基因分型

目的对海南省性病门诊泌尿生殖道沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)感染状况及其基因分型进行初步研究,了解泌尿生殖道CT感染人群的流行特点和型别特征,为制定科学防护策略和措施提供依据。方法收集2018—2022年就诊于海南省第五人民医院性病门诊的5551份男性尿道拭子标本和女性宫颈拭子标本,利用实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测CT感染情况,取部分CT阳性者的DNA进行巢式PCR扩增OMPL基因,并对阳性结果进行测序,测序结果上传至BLAST网站查找序列的相似性,构建系统发育树,确定基因型。结果5551例感染者有846例CT感染阳性,阳性感染率为15.2%。其中男性CTDNA阳性检出率为18.6%,女性为13.4%,男性阳性检出率高于女性;各年龄段CT-DNA的阳性检出率差异有统计学意义(P<0.05),20~<30岁的CT-DNA阳性率最高为58.0%,50岁及以上CT-DNA的阳性率最低为1.0%;不同季节间CTDNA的阳性检出率差异有统计学意义(P<0.05),夏季最高为36.4%,冬季最低为9.6%。取海南地区部分标本进行CTOMPL基因VS1~VS2核苷酸序列分型,共测得6个基因型,包括D、E、G、F、J和K型,其中F型为主要流行优势型。结论海南地区CT感染与性别、年龄和季节有关,基因感染型呈现多元化,F型为主要流行优势型。在今后的性病防治工作中有必要进一步加强育龄期男女生殖道CT感染的筛查力度,提高生育率。

赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白新基因ompL17基因靶向敲除及其突变株的构建

目的将外膜蛋白新基因ompL17靶向敲除并构建该基因的突变株。方法提取钩端螺旋体017株基因组DNA,扩增出外膜蛋白新基因ompL17,与打靶载体p2NIL重组,并插入氨苄抗生素抗性基因Ampr+使外膜蛋白新基因ompL17失活,构建重组的基因打靶质粒p2NIL17A。电穿孔转化入钩体017株中构建突变株,通过豚鼠模型观察该突变株的毒力变化。结果PCR、Dotblot和酶切分析,证实构建了以氨苄青霉素抗性基因DNA为标记探针的基因打靶载体,并构建外膜蛋白新基因ompL17敲除的钩体017株突变株。结论成功将钩体外膜蛋白的新基因ompL17进行靶向敲除,并构建钩体017株突变株,为进一步进行该基因的功能研究和阐明赖型钩体致病的分子机制奠定了基础。